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    Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化蛞貝平喘膠囊提取工藝的研究*

    2019-04-27 02:00:36安葉晶晶金湛程
    浙江中醫(yī)雜志 2019年4期
    關(guān)鍵詞:貝母乙醇供試

    沈 安葉晶晶金 湛程 斌

    1 浙江省寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315010

    2 臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))路橋醫(yī)院 浙江 臺(tái)州 318050

    3 衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江 衢州 324000

    4 浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 浙江 寧波 315100

    “蛞貝平喘膠囊”是根據(jù)《黎陽(yáng)王氏秘方》中所載“玉涎丹”開(kāi)發(fā)的制劑,由蛞蝓、浙貝母、蛤蚧、黨參等組成,具有補(bǔ)肺益腎、清熱化痰、降氣平喘之功效,可用于治療支氣管性氣喘。其有效成分為貝母素甲、貝母素乙等多種異甾體類(lèi)生物堿,以及多糖類(lèi)化合物,為了保證該制劑中有效成分的提取率,筆者采用響應(yīng)面分析-綜合評(píng)分法優(yōu)化其提取工藝,為該制劑的深入研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器:Agilent1260型高效液相色譜儀(配蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,美國(guó)Agilent公司);UV1902型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司);AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海恒一科技有限公司);ZN-100型高速中藥粉碎機(jī)(杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司)。

    1.2 材料:貝母素甲對(duì)照品(HPLC≥98%,批號(hào):110750-201110),貝母素乙對(duì)照品(HPLC≥98%,批號(hào):110751-201111),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;D-無(wú)水葡萄糖(批號(hào):20130910),購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;水為雙蒸水,乙腈、甲醇均為色譜純;其余試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 樣品中貝母甲素、貝母乙素的含量測(cè)定:分述如下。

    2.1.1 色譜條件:KromasilC18色譜柱(250.0mm×4.6mm,5μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:乙腈-水-二乙胺(70∶30∶0.03);檢測(cè)波長(zhǎng):270nm;流速:1.0ml/min;進(jìn)流速:2.0L/min[1]。

    2.1.2 對(duì)照品溶液制備:取貝母素甲和貝母素乙的對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加甲醇制成每1ml含貝母素甲1.820mg、貝母素乙1.850mg的混合溶液,搖勻,作為混合對(duì)照品母液。精密吸取該母液5ml,用甲醇稀釋至50ml,得每1ml含貝母素甲0.182mg、貝母素乙0.185mg的混合對(duì)照品溶液,備用。

    2.1.3 供試品溶液制備:取浸膏0.2g,精密稱(chēng)定,置具塞刻度試管中,精密加入10ml乙醚和0.2ml濃氨試液,密塞,稱(chēng)定重量,超聲5min,冷浸24h,加上述混合溶液補(bǔ)足減失的重量。精密量取樣品上清液1ml,蒸干,殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至2ml容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,過(guò)膜,即得[2]。

    2.1.4 陰性供試品溶液制備:除浙貝母外,分別按處方稱(chēng)取其余藥味,提取制成浸膏,余同“2.1.3”項(xiàng)。

    2.1.5 空白實(shí)驗(yàn):分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液10μl,進(jìn)樣測(cè)定。在確定的色譜條件下,貝母素甲和貝母素乙色譜峰的分離情況較好,其余成分未對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾。

    2.1.6 線性關(guān)系考察:分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1.0ml、3.0ml、5.0ml、7.0ml、9.0ml、10.0ml至10ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得6個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液各10μl,進(jìn)樣測(cè)定。以濃度C(mg/ml)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以貝母素甲、貝母素乙的平均峰面積的對(duì)數(shù)值A(chǔ)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程分別為,lgA甲=1.1601gm甲+2.0079(r=0.9998),lgA乙=1.1467lgm乙+2.0275(r=0.9997),貝母素甲、貝母素乙分別在0.0182mg/ml~0.182mg/ml、0.0185mg/ml~0.185mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.1.7 精密度實(shí)驗(yàn):精密吸取混合對(duì)照品溶液10μl,連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示,貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為0.69%、0.54%,表明儀器精密度良好。

    2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):精密吸取供試液10μl,于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示貝母素甲、貝母素乙峰面積的RSD分別為0.76%、0.25%,表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.1.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取同一批樣品浸膏6份,每份0.2g,精密稱(chēng)定,按“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示樣品中貝母素甲、貝母素乙含量的RSD分別為1.0%、0.94%,表明方法的重復(fù)性良好。

    2.1.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn):取已知含量的樣品浸膏9份,每份0.2g,精密加入濃度為0.367mg/ml的混合對(duì)照液5.4ml、3.6ml、1.8ml各3份,按“2.1.3”項(xiàng)下制備方法,在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品中指標(biāo)成分貝母素甲和貝母素乙的總含量,測(cè)得平均加樣回收率為94.66%,RSD為3.09%。

    2.2 樣品中多糖含量測(cè)定:分述如下。

    2.2.1 對(duì)照品溶液制備:取干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,置于50ml量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得每1ml含葡萄糖0.1025mg的對(duì)照品溶液。

    2.2.2 供試品溶液制備:精密吸取乙醇提取液2.0ml,置于10ml干燥試管中,再加入5%苯酚水溶液1.0ml,混均,快速加入硫酸6.0ml,混均,冷卻后,在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度[3]。

    2.2.3 線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml,并以第1份為空白對(duì)照,以無(wú)水葡萄糖含量為橫坐標(biāo),以吸收度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得方程為A=0.7630m+0.1586(r=0.9943),在0.0205~0.1230mg范圍內(nèi)線性良好(r=0.9981)。

    2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液,連續(xù)測(cè)定吸光度6次,RSD為0.98%,表明儀器的精密度良好。

    2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一供試品溶液,按照上述方法測(cè)定0、1、2、3、4、5h內(nèi)的吸光度,RSD為1.1%,表明供試品溶液在5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取同一批次樣品6份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,照上述方法分別測(cè)定其吸光度,RSD為2.56%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn):取含有量已知的供試品溶液6份,精密加入同一濃度的對(duì)照品溶液,按上述方法測(cè)定吸光度,測(cè)得平均加樣回收率為98.0%,RSD為2.03%。

    2.3 單因素實(shí)驗(yàn):分述如下。

    2.3.1 乙醇濃度:精密稱(chēng)取處方藥材6份,加10倍量30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇,80℃條件下,提取2次,每次2h,計(jì)算出膏率,按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定貝母素甲、貝母素乙的含量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總多糖含量,因方中蛞蝓未收入藥典,浙貝母除了藥典規(guī)定的甾體類(lèi)生物堿貝母甲素和貝母乙素含量,其有效成分之一多糖也具有獨(dú)特和顯著的藥理作用。此外,黨參中含有含量豐富的多糖,蛤蚧主要以醇浸出物測(cè)定為主。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)定貝母素甲和貝母素乙總量的權(quán)重為50%,總多糖權(quán)重為30%,出膏率權(quán)重為20%。結(jié)果表明,各乙醇濃度條件下的綜合評(píng)分分別為81.27%、83.55%、90.53%、91.37%、94.78%、93.20%,即70%乙醇時(shí)最高。因此,選擇60%、70%、80%作為乙醇濃度的3個(gè)水平。

    2.3.2 提取溫度:稱(chēng)取處方藥材4份,加10倍量70%乙醇,于50℃、60℃、70℃、80℃提取2次,每次2h,計(jì)算出膏率,按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定貝母素甲、貝母素乙的含量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總多糖含量。結(jié)果表明不同溫度條件下的綜合評(píng)分分別為90.48%、91.43%、92.35%、92.78%,以80℃條件下評(píng)分最高。但是綜合評(píng)分并沒(méi)有顯著提高,考慮到溫度是影響有效成分溶出的重要因素,因此,選擇60℃、70℃、80℃作為提取溫度的3個(gè)水平。

    2.3.3 料液比:稱(chēng)取處方藥材4份,分別加入6、8、10、12倍量70%乙醇,于80℃提取2次,每次2h,計(jì)算出膏率,按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定貝母素甲、貝母素乙的含量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總多糖含量。結(jié)果表明,不同料液比條件下的綜合評(píng)分分別為89.48%、91.33%、94.56%、93.77%,即10倍量乙醇條件下最高。因此,選擇8、10、12倍量70%乙醇作為料液比的3個(gè)水平。

    2.3.4 提取時(shí)間:稱(chēng)取處方藥材4份,分別加入10倍量70%乙醇,于80℃提取2次,每次1、2、3、4h,計(jì)算出膏率,按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定貝母素甲、貝母素乙的含量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總多糖含量。結(jié)果表明不同提取時(shí)間條件下的綜合評(píng)分分別為88.72%、92.63%、92.88%、93.12%,即在4h條件下評(píng)分最高。從生產(chǎn)角度出發(fā),為了節(jié)省時(shí)間與原來(lái),選取提取2h為最佳提取時(shí)間。

    2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別提取1、2、3、4次,提取2次時(shí),綜合評(píng)分有著顯著的提升,之后,逐漸趨于平緩,從實(shí)際生產(chǎn)角度考慮,故我們選擇提取次數(shù)為2次。單因素實(shí)驗(yàn)表明,提取時(shí)間越長(zhǎng)綜合評(píng)分愈高,但提取時(shí)間2h后評(píng)分變化幅度不大,從實(shí)際生產(chǎn)角度考慮,故我們選擇提取時(shí)間為2h。其余選擇影響相對(duì)較大的3個(gè)因素,即乙醇濃度(X1)、提取溫度(X2)和料液比(X3),以綜合評(píng)分Y[含出膏率(Y1、%)、貝母甲素和乙素總量(Y2、%)、總多糖提取率(Y3、%)]為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)定出膏率權(quán)重為20%,貝母素甲和貝母素乙總量為50%,總多糖為30%,計(jì)算公式為:綜合評(píng)分Y=(Y1/Y1-max)×Y1權(quán)重+(Y2/Y2-max)×Y2權(quán)重+(Y3/Y3-max)×Y3權(quán)重。分述如下。

    2.4.1 模型擬合與方差分析:運(yùn)用Desing-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面分析,對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)式回歸擬合,得方程為Y=93.626+7.80X1+5.13X2+6.16X3+5.69X1X2+0.68X1X3-0.31X2X3-8.77X12-8.17X22-8.55X32。對(duì)回歸方程進(jìn)行方法分析,結(jié)果見(jiàn)表1,由表可得各因素中對(duì)蛞貝平喘膠囊提取工藝的條件影響程度的大小依次為X1(乙醇濃度)>X3(料液比)>X2(提取溫度)。

    表1 方差分析

    圖1 提取溫度與乙醇濃度的交互作用

    圖2 料液比與乙醇濃度的交互作用

    圖3 料液比與提取溫度的交互作用

    2.4.2 各因素之間的交互作用:運(yùn)用Desing-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖以及等高線圖,見(jiàn)圖1~3。圖1顯示,當(dāng)提取溫度一定時(shí),隨著乙醇濃度的增加,綜合評(píng)分逐漸上升后緩慢下降;當(dāng)乙醇濃度一定時(shí),提取溫度在60~70℃,綜合評(píng)分呈上升趨勢(shì),后逐漸下降。圖2顯示,當(dāng)料液比一定時(shí),在一定范圍內(nèi)綜合評(píng)分隨著乙醇濃度的增加而上升,而后逐漸下降;當(dāng)乙醇濃度一定時(shí),料液比在8~10g/ml時(shí),綜合評(píng)分逐漸上升,而后趨于平緩。圖3顯示,當(dāng)料液比一定時(shí),提取溫度在一定范圍內(nèi)有利于綜合評(píng)分的升高,但在75~80℃,綜合評(píng)分逐漸降低。當(dāng)提取溫度一定時(shí),隨著料液比的增加,綜合評(píng)分逐漸上升而后緩慢下降。同時(shí),圖1中乙醇濃度與提取溫度的交互作用最顯著(P<0.05),響應(yīng)曲線坡度較陡,等高線呈橢圓形,而且比較密集。

    2.4.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn):對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于0,解得X1=0.630,X2=0.527,X3=0.376,轉(zhuǎn)換后,得Z1=76.30,Z2=75.27,Z3=10.75,并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行修正,得乙醇濃度為76%,提取溫度為75℃,料液比為10.8,綜合評(píng)分理論預(yù)測(cè)值為98.59%,實(shí)際測(cè)定與理論預(yù)測(cè)基本符合,說(shuō)明得到的二次回歸方程與實(shí)際操作擬合良好。

    3 討論

    蛞貝平喘膠囊方中蛞蝓祛風(fēng)定驚,清熱解毒;浙貝母清熱散結(jié),化痰止咳;蛤蚧補(bǔ)肺益腎,納氣定喘;黨參補(bǔ)中益氣,和脾胃,除煩渴。蛞蝓含蛋白、多糖類(lèi)等多種成分,有抗腫瘤、平喘等作用。浙貝母主要成分是貝母甲素以及貝母已素,具有鎮(zhèn)咳、祛痰和松弛氣管平滑肌、抗炎和逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥等作用。蛤蚧中含有高量的鈣、鋅、膽固醇以及甘油酯,能夠解痙平喘、降低血糖、提高免疫力。黨參具有調(diào)節(jié)血糖、促進(jìn)造血機(jī)能、降壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)胃收縮及抗?jié)兊榷喾N作用。

    蛞貝平喘膠囊在提取時(shí),方中浙貝母和黨參粉粹,過(guò)5號(hào)篩,烘干,備用。蛤蚧除去鱗片及頭足,切成小塊,烘干,粉碎,過(guò)5號(hào)篩;蛞蝓冷阱溫度-85℃冷凍干燥,干燥后低溫粉碎,過(guò)5號(hào)篩;按照響應(yīng)面設(shè)計(jì)所優(yōu)化的工藝條件,以上四味藥材,用76%乙醇提取,每次用10.8倍量,提取溫度75℃,回流2次,每次2h,提取液濾過(guò),濾液減壓濃縮至稠膏,按處方比例稱(chēng)量,用適量的95%乙醇潤(rùn)濕,過(guò)80目篩制粒,將制得的濕顆粒于40℃下減壓干燥,整粒,加5%滑石粉和0.3%硬脂酸鎂為潤(rùn)滑劑,混合均勻,填充,即可。

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