基于大鼠體內(nèi)IGFBP7的表達(dá)探討雪蟾膠囊抗肝纖維化作用機(jī)制*

唐存祥 倪衛(wèi)東 凌 云 陳永堂 劉玉娟

1 浙江省長(zhǎng)興縣中醫(yī)院 浙江 長(zhǎng)興 313100

2 江蘇省句容市中醫(yī)院 江蘇 句容 212400

3 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇 南京 210000

4 山東省青島市第六人民醫(yī)院 山東 青島 266000

肝纖維化是各種慢性肝病在發(fā)展至肝硬化過程中的必經(jīng)病理變化。多種細(xì)胞因子介入肝纖維化發(fā)展，是肝星狀細(xì)胞（HSC）活化及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積和增加的重要因素。目前研究表明胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7（IGFBP7）可通過ERK1/2通路激活HSC、誘導(dǎo)ECM沉積，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1]。本研究通過實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠體內(nèi)IGFBP7的表達(dá)，以探討雪蟾膠囊抗肝纖維化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料:SD雄性大鼠32只，180g～200g，購自南京拜睿生物有限公司。雪蟾膠囊，購自上海綠雅堂醫(yī)療公司。秋水仙堿，購自云南昆藥集團(tuán)公司。ELISA試劑盒購自慧嘉生物有限公司，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)儀購自RAYTO RT-6000，37℃孵育箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 動(dòng)物造模及分組:本實(shí)驗(yàn)取大鼠5只作為正常組，27只用來制作肝纖維化模型。將造模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，給予高脂、低蛋白質(zhì)飼料（豬油20%+膽固醇0.5%+玉米粉79.5%）2周，再皮下注射40%四氯化碳（CCL4）橄欖油溶液，3ml/kg，3次/周，持續(xù)4周。造模結(jié)束，隨機(jī)處死2只，確定造模成功。將余下造模成功的25只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法平分為5組，即:模型組、秋水仙堿組、雪蟾膠囊低、中、高劑量組。藥物組每日分別給予秋水仙堿（0.1mg/kg）、雪蟾膠囊（按低、中、高劑量分組分別給予0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg），灌胃給藥，連續(xù)4周。模型組及正常組按10ml/kg·d生理鹽水灌胃。

1.3 ELISA檢測(cè)IGFBP7的表達(dá):在第11周末，大鼠末次給藥后禁食、自由飲水15h，用10%水合氯醛（4.0ml/kg）腹腔注射麻醉，開腹，腹主動(dòng)脈采血，分離血清作為樣品。加一定稀釋的樣品0.1ml于已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1h。同時(shí)做空白孔、陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔。PBST洗滌5次，每次30s。各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml，37℃孵育0.5～1h。再PBST洗滌5次，每次30s，加臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃，10～30min，使底物液顯色。各孔加入2M硫酸0.05ml終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

相對(duì)于模型組，各組大鼠血清中IGFBP7均有明顯下降（P＜0.05）。在抑制大鼠血清中IGFBP7的相對(duì)表達(dá)量方面，雪蟾膠囊3個(gè)劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，且雪蟾膠囊高劑量組優(yōu)于秋水仙堿組。見表1。

表1 各組的IGFBP7指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s)

表1 各組的IGFBP7指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05；與高劑量組比較，ΔP＜0.05。

分組正常組模型組秋水仙堿組雪蟾膠囊低劑量組雪蟾膠囊中劑量組雪蟾膠囊高劑量組IGFBP7（ng/ml）101.51±13.70*824.04±65.83 216.87±24.32*Δ 647.88±23.65*Δ 299.39±28.67*Δ 136.87±9.55*例數(shù)5 5 5 5 5 5

3 討論

肝纖維化可歸屬于中醫(yī)學(xué)“癥積”“鼓脹”“脅痛”“黃疸”等范疇。其病機(jī)虛實(shí)夾雜，以“正虛血瘀”為主，可夾雜濕熱、氣郁、痰濁等因素[2]。雪蟾膠囊主要成分為干蟾皮、雪靈芝?！侗静菥V目拾遺》曰:“蟾皮，此乃癩蝦蟆皮也，能拔大毒外出，又能回毒?！毖╈`芝性味甘寒，入肝、膽、脾經(jīng)，清熱解毒，滋陰養(yǎng)血，益腎壯骨，利膽除黃。二者合用在消積、除濕、解毒的同時(shí)，扶助正氣，補(bǔ)益肝腎，組方符合肝纖維化“虛實(shí)夾雜”病機(jī)。結(jié)果提示，雪蟾膠囊抗肝纖維化作用，可能與抑制IGFBP7的表達(dá)有關(guān)。同時(shí)，隨著劑量的增加，抑制IGFBP7表達(dá)效果越好。與西藥秋水仙堿組比較，雪蟾膠囊高劑量組對(duì)于IFGBP7的表達(dá)抑制更強(qiáng)。能否以雪蟾膠囊替代秋水仙堿抗肝纖維化治療，需進(jìn)一步觀察。