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    蛇六谷中魔芋葡甘露聚糖對荷Lewis肺癌小鼠脾細胞NF-κB、IκB表達的影響

    2019-04-27 02:00:36微張鑫潘磊陳培豐
    浙江中醫(yī)雜志 2019年4期
    關鍵詞:荷瘤工作液脾臟

    徐 微張 鑫潘 磊陳培豐#

    1 浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 浙江 杭州 310053

    2 河南省新密市中醫(yī)院 河南 新密 452370

    3 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

    蛇六谷,又名魔芋,性味辛寒,有小毒,具有化痰散結、行瘀消腫止痛等功效,作為抗癌中藥在浙滬地區(qū)廣泛使用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蛇六谷中魔芋葡甘露聚糖(KGM)含量最多,約占50%~60%,是蛇六谷抗腫瘤作用的主要成分[1]。本實驗在建立Lewis肺癌小鼠動物模型的基礎上,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測KGM對荷瘤小鼠脾細胞核轉錄因子-κB(NF-κB)、核因子-κB抑制因子(IκB)表達的影響,為KGM的抗腫瘤作用提供一定的分子學依據(jù)。

    1 實驗材料

    1.1 實驗動物:SPF級近交C57BL/6純系小鼠50只,雄性,6~8周齡,體重16~20g;Lewis荷瘤小鼠4只,均購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。動物合格證號:SCXK:(滬)2013-0016,飼養(yǎng)于我校動物實驗中心SPF級動物房。

    1.2 實驗藥物:純化魔芋微粉,成都市圣特蒙魔芋微粉有限責任公司,批號:140305,KGM含量為98%。環(huán)磷酰胺(CTX),0.2g/瓶,山西普德藥業(yè)股份有限公司生產,批號:04141103。

    1.3 試劑及儀器:RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶,美國Gibco公司;紅細胞裂解液,Beyotime公司;PBS(磷酸鹽緩沖液),吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,上海翊圣生物科技有限公司;小鼠NF-κB ELISA和IκB ELISA試劑盒,上海翔升生物科技有限公司。

    2 實驗方法

    2.1 造模及分組方法:在無菌條件下,頸椎脫臼法處死4只荷Lewis肺癌小鼠,取生長良好的新鮮腫瘤組織,剔除包膜及壞死組織,剪碎,勻漿,過濾制成混懸液,離心后加生理鹽水,將細胞濃度調整至1×107/ml。在無菌條件下以0.2ml/只(含瘤細胞數(shù)2×106個)接種于50只C57BL/6小鼠右側腋窩皮下,30min內完成。接種24h后,將50只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組,分別為荷瘤空白對照組(NS組),陽性對照組(環(huán)磷酰胺組,CTX組),KGM低、中、高劑量組,每組10只并稱重。

    2.2 給藥方法:參考林慧敏等[2]的給藥方法,將KGM溶于水,其中KGM低、中、高劑量組分別按100mg/(kg·d)、200mg/(kg·d)、300mg/(kg·d)連續(xù)灌胃13d,每日總量0.2ml;生理鹽水組以等劑量灌胃生理鹽水13d;環(huán)磷酰胺組給藥劑量參照人鼠給藥劑量換算,以30mg/kg腹腔注射給藥,2次/周,共計4次。

    2.3 脾臟標本采集:給藥后第14d頸椎脫臼處死小鼠,置于75%的酒精中浸泡5min,在超凈工作臺上,用無菌剪刀快速剪開小鼠皮膚,以新的無菌剪刀剪開腹膜,取出脾臟,放入液氮中冷凍備用。

    2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測脾臟細胞中NF-κB和IκB-α的表達:分述如下。

    2.4.1 蛋白提取:采用液氮充分研磨脾組織,加入200μl蛋白提取緩沖液(50mM Tris HCl pH 7.6,1mM CaCl2,0.2%Triton X-100,0.5mM PMSF),充分振蕩混勻,室溫裂解10min。離心機轉速調整至12000rpm,離心10min,離心結束后將上清液轉至新的離心管中,放于-80℃冰箱備用。

    2.4.2 蛋白濃度測定分析:①配置統(tǒng)一的蛋白質標準品(規(guī)格見表1):以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的標準品溶液(濃度為2mg/ml)制作蛋白質濃度標準曲線。分別吸取BSA標準品溶液0μl、25μl、50μl、125μl、150μl、350μl、375μl、395μl 和400μl,各自加入0.01MPBS溶液補足到2000μl,配成梯度濃度的標準品溶液,分裝后-20℃保存,備用。②配制BCA工作液:計算所需要的總BCA工作液體積??侭CA工作液體積=(BSA標準品+待測樣品)×重復數(shù)×每個樣品所需要的BCA工作液;將BCA試劑A和B按照50∶1的體積比混合均勻,注意二者混合后迅速渾濁,混勻后混合物迅速變澄清。將上述步驟所得混合工作液裝入密封容器內,室溫條件24h穩(wěn)定。

    表1 配置BSA標準品體系

    2.4.3 微孔板檢測方法(樣品:BCA工作液=1∶8):各取10標準品和待測樣品加入到微孔板中(即1∶20),試劑盒的檢測范圍為125~2000μg/ml。注意:待測樣品要先稀釋一定的倍數(shù)再進行測量,稀釋的倍數(shù)需進行摸索。在每孔中加入200μl BCA工作液,振蕩30s混合均勻。蓋上微孔板,37℃條件下孵育30min。室溫冷卻,在酶標儀上的562nm波長范圍處檢測吸光度。繪制標準曲線,計算蛋白濃度。

    2.5 統(tǒng)計學方法:采用SPSS17.0軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,最終結果以±s的形式表示,樣本符合正態(tài)分布且方差齊性時,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義差異。

    3 結果

    3.1 成功建立小鼠移植瘤模型:接種7d后可在各小鼠腋窩皮下觸及米粒大小的結節(jié),質硬,活動度一般,邊界清楚,表面凹凸不平,連續(xù)觀察13d,期間小鼠腋下結節(jié)增大明顯,表示移植瘤接種成功,符合實驗要求。

    3.2 KGM對荷瘤小鼠脾細胞NF-κB、IκB表達的影響:見表2。

    表2 KGM對荷瘤小鼠脾臟細胞NF-κB、IκB表達的影響(±s,pg/ml)

    表2 KGM對荷瘤小鼠脾臟細胞NF-κB、IκB表達的影響(±s,pg/ml)

    注:與NS組比較,☆P<0.05,△P<0.01;與CTX組比較,▲P<0.01。

    IκB表達量39.28±5.95▲64.04±6.55△45.78±2.98▲49.01±3.91☆▲66.96±5.69△組別NS組CTX組KGM低劑量組KGM中劑量組KGM高劑量組例數(shù)10 10 10 10 10 NF-κB表達量360.83±16.71▲245.35±24.35△334.79±15.59▲316.13±29.83☆▲246.41±10.76△

    4 討論

    我們前期研究發(fā)現(xiàn)KGM可有效抑制荷瘤小鼠瘤體的生長,提高荷瘤小鼠的胸腺和脾臟指數(shù),而且荷瘤小鼠脾細胞中T細胞增殖分化也有顯著提高;還可能通過影響THP-1源巨噬細胞白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ干擾素(IFN-γ)mRNA及蛋白的表達來達到免疫調節(jié)的作用,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。故提高荷瘤小鼠的免疫功能可能是KGM抗腫瘤的機制之一。關于KGM的抗腫瘤機制應該還有很多,本實驗則嘗試從抑制腫瘤血管生成方面探討KGM的可能作用機制。

    抑制腫瘤血管生成是防止腫瘤侵襲及轉移、改善患者預后和提高生存率的重要措施之一。目前研究已發(fā)現(xiàn)30余種促血管生成因子,其中血管內皮細胞生長因子(VEGF)是重要的因子之一。NF-κB是一類普遍存在的轉錄調節(jié)因子,有抑制凋亡、促進腫瘤細胞增殖、血管生成和轉移等作用。VEGF的表達與NF-κB成正相關,在腫瘤的血管形成中NF-κB起著核心作用,可通過上調核心因子VEGF的表達來促進腫瘤血管形成。而NF-κB的激活受其抑制因子——IκB(尤其是IκB-α)的調控。IκB可通過與NF-κB二聚體結合,形成NF-κB/IκB復合物。外源性刺激通過活化IκB激酶(IKK)使得IκB磷酸化,并進一步降解,使NF-κB發(fā)生核異位,與靶基因的特異位點相結合,從而使NF-κB失去活性,抑制腫瘤生長及減少新生血管生成。所以NF-κB、IκB二者在腫瘤的形成及發(fā)展過程中具有舉足輕重的作用。

    本實驗通過檢測荷瘤小鼠脾細胞NF-κB及IκB的表達發(fā)現(xiàn),荷瘤空白對照組中NF-κB表達量最高,而IκB表達量最低,隨著KGM用藥濃度的增加,NF-κB的表達量逐漸降低,IκB的表達則逐漸上升,雖然三個KGM給藥組之間并無顯著性差異(P>0.05),但仍具有一定的量效關系。故我們認為,KGM的抗腫瘤作用也可能是通過下調NF-κB并且上調IκB的表達,或者穩(wěn)定IκB的活性、抑制了VEGF的表達,從而抑制了腫瘤新生血管的生成,進而抑制了腫瘤的增殖及轉移來實現(xiàn)的。所以,KGM的抗腫瘤機制仍需要進一步的深入探討。

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