miR-216a在胃癌組織和患者血漿中的表達(dá)變化及臨床意義*

張 同，李 慶，舒 若，徐 玉，施承民，曾玉劍，孫 亮，田 衍，肖博凱，王昆華，羅華友

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸與疝外科/云南省消化病研究所/云南省消化道疾病防治工程技術(shù)研究中心，昆明 650032)

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，具有較高的致死率，并且在我國發(fā)病率較高。近年來，手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療等取得了一定成效[1-2]，但是淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等問題依然嚴(yán)重[3]。miRNA通過與靶基因相互作用，在腫瘤發(fā)生過程中起著重要的調(diào)控作用[4-6]。許多miRNA已經(jīng)在胃癌相關(guān)方面研究中應(yīng)用，如miR-21[6]、miR-141[3]和miR-30b[7]等。miR-216a最初報道與急性胰腺炎相關(guān)[8]，而后報道參與了胰腺癌[9-11]、肝癌[12]、肺癌[13]、卵巢癌[14]和腎癌[15]等的發(fā)生。miR-216a在胃癌方面的研究多在細(xì)胞水平進(jìn)行[16-18]，臨床研究報道較少，且關(guān)于其在胃癌組織中的表達(dá)變化存在分歧[18-19]。因此，本研究比較分析miR-216a在胃癌組織和患者血漿中的表達(dá)水平，以及手術(shù)前后的表達(dá)變化，旨在為胃癌的臨床診斷和治療預(yù)后提供一些參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月至2014年12月在本院接受手術(shù)治療的胃癌患者120例作為觀察組，同時選取120例健康志愿者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)診斷為腺癌；患者術(shù)前未行放射治療、化學(xué)治療、靶向治療等抗腫瘤治療；患者或其家屬自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)診斷為非腺癌；術(shù)后3年的隨訪資料不完整。觀察組男79，女41，平均年齡(61.52±8.96)歲。對照組男66例，女54例，平均年齡(55.24±7.46)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1樣品收集 采集胃癌患者的腫瘤組織(非壞死部分)和對應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤組織5～10 cm)約0.2 g，手術(shù)切除標(biāo)本立即放入液氮中，隨后置入-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩２杉赴┗颊呤中g(shù)前、手術(shù)后第7天血液，以及健康志愿者血液各3 mL。血液樣品在乙二胺四乙酸(EDTA)采血管中室溫靜置約30 min后，4 ℃下3 500 r/min離心5 min，收集血清，然后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞成分，收集上層血漿，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2RNA提取 按照GenEluteTMPlasma/Serum RNA Purification Mini Kit試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)方法抽提、保存患者胃癌組織標(biāo)本和血漿標(biāo)本中的總RNA，利用熒光分光光度計(美國Thermo Fisher公司)測定血漿RNA水平。提取的RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照Taq-Man miRNA Reverse Transcription試劑盒(美國Applied BioSystems公司)說明合成cDNA，miR-216a和U6的特異性引物見表1。

1.2.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 利用SYBR Master mix試劑盒(日本Toyobo公司)在ABI 7500 RT-PCR儀(美國Applied BioSystems公司)上對上述合成的cDNA進(jìn)行檢測。每個反應(yīng)重復(fù)3次。miR-216a和U6的RT-qPCR引物序列見表1。以U6小環(huán)RNA作為內(nèi)參[17，20]，結(jié)果采用2-△△Ct相對定量法[21]計算。

表1 RT-qPCR所用引物序列

F：正向；R:反向

1.2.4其他方法及術(shù)后隨訪 本試驗選取的胃癌患者均采用腹腔鏡或開腹胃癌根治術(shù)[1-2]進(jìn)行治療。胃癌組織幽門螺桿菌(Hp)采用硼酸亞甲藍(lán)染色方法[22]檢測。術(shù)后3年內(nèi)平均每3個月隨訪1次，記錄腫瘤復(fù)發(fā)和患者死亡等情況。

2 結(jié) 果

2.1miR-216a在胃癌組織中的表達(dá)降低 RT-qPCR檢測結(jié)果表明，miR-216a在胃癌患者非壞死胃癌組織中的相對表達(dá)水平低于對應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.01

圖1 miR-216a在癌旁組織和胃癌組織中的表達(dá)水平比較

2.2手術(shù)前后miR-216a在胃癌患者血漿中的表達(dá)變化 手術(shù)前，觀察組胃癌患者血漿miR-216a表達(dá)水平高于對照組健康人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。手術(shù)后，胃癌患者血漿miR-216a表達(dá)水平低于手術(shù)前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

表2 胃癌患者臨床病理特征與miR-216a相對表達(dá)水平的相關(guān)性

2.3miR-216a的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 胃癌組織中miR-216a相對表達(dá)水平與患者性別、年齡、Laurén分型、Hp感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小均無關(guān)(P>0.05)。胃癌患者術(shù)前血漿miR-216a相對表達(dá)水平與性別、年齡、Laurén分型和Hp感染均無關(guān)(P>0.05)。胃癌組織miR-216a相對表達(dá)水平與腫瘤分化程度和TNM分期相關(guān)(P<0.05)。術(shù)前血漿miR-216a相對表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小均相關(guān)(P<0.05)，見表2。

*：P<0.01；#：P<0.05

圖2 手術(shù)前后miR-216a在胃癌患者血漿中的表達(dá)水平

2.4miR-216a表達(dá)水平與胃癌患者治療預(yù)后的相關(guān)性 按照miR-216a的相對表達(dá)水平將胃癌患者劃分為高值組和低值組，相對表達(dá)水平大于或等于平均相對表達(dá)水平的患者歸為高值組，相對表達(dá)水平小于平均相對表達(dá)水平的患者歸為低值組。分組及胃癌患者術(shù)后3年內(nèi)的復(fù)發(fā)率和生存率見表3。胃癌組織miR-216a高值組的術(shù)后復(fù)發(fā)率和生存率較優(yōu)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。患者血漿miR-216a低值組的復(fù)發(fā)率和生存率優(yōu)于高值組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 miR-216a表達(dá)水平與胃癌手術(shù)治療預(yù)后的關(guān)系

-：無數(shù)據(jù)

3 討 論

胃癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家致死率尤其高。有研究報道，早期診治的胃癌患者其生存率可以有效提高[2，4]。此外，由于預(yù)后不良，即使是經(jīng)根治性切除手術(shù)，或者聯(lián)合放射治療、化學(xué)治療等方式，胃癌患者的生存率也不高[1，5]。因此，探尋新的生物靶點或標(biāo)記物在胃癌早期診斷、治療預(yù)后等方面有重要意義[4，6]。

本研究同時收集了胃癌患者的腫瘤組織、癌旁組織和手術(shù)前后患者血漿，利用RT-qPCR技術(shù)對miR-216a的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果顯示，miR-216a在患者胃癌組織中的相對表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(P<0.01)，這與miR-216a在胰腺癌和卵巢癌等其他癌癥患者腫瘤組織中的表達(dá)結(jié)果一致[9，14，18]。此外，miR-216a在胃癌患者手術(shù)前血漿中的相對表達(dá)水平明顯高于對照組健康人群(P<0.01)，這也與其在胰腺炎等患者血漿中觀測的表達(dá)結(jié)果一致[23]。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃癌組織和患者血漿中miR-216a的相對表達(dá)水平均與腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)(P<0.05)。但是，未+低分化和Ⅲ+Ⅳ分期患者組織中miR-216a表達(dá)分別低于中+高分化和Ⅰ+Ⅱ分期患者，而血漿中miR-216a表達(dá)與此相反。這可能與miR-216a作為抑癌因子抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)[16，18]，而由于組織和血漿中miR-216對癌變響應(yīng)的時效性不同[8]，使得它們在相同分化程度和分期患者中的表達(dá)差異明顯。這與其他抑癌因子如miR-141-3p等的表達(dá)模式類似[3]。這些結(jié)果表明，miR-216a在患者胃癌組織和血漿中的表達(dá)變化差異均較為明顯，且與胃癌臨床病理特征存在相關(guān)性。因此，miR-216a可能在胃癌的早期診斷中有一定的臨床價值。

進(jìn)一步分析表明，接受手術(shù)治療后，胃癌患者血漿miR-216a相對表達(dá)水平明顯低于手術(shù)前(P<0.05)。目前，對miR-216a在胃癌或其他癌癥患者手術(shù)前后血漿中的表達(dá)變化研究較少，難以對此趨勢作比較驗證。但是，該結(jié)果說明miR-216a可以作為胃癌手術(shù)療效評價的相關(guān)指標(biāo)。并且，miR-216a在胃癌患者血漿中的相對表達(dá)水平與患者術(shù)后復(fù)發(fā)率和生存率存在相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，手術(shù)前血漿miR-216a低表達(dá)患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率和生存率均優(yōu)于高表達(dá)患者(P<0.05)。此外，由于無創(chuàng)、穩(wěn)定性好、檢測結(jié)果可靠等特點[4]，臨床檢測胃癌患者血漿miR-216a表達(dá)水平對胃癌早期診斷和治療預(yù)后具有潛在的重要意義。