多芯片整合分析腰椎間盤突出癥發(fā)生相關(guān)的分子通路及關(guān)鍵基因研究*

劉權(quán)祥，陳 錢，齊明宇，莊新明，郭建平△，李增新，程 維，代起志

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院骨外二科，吉林吉林 132011；2.吉林省吉林市中心醫(yī)院內(nèi)分泌骨代謝科 132011；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院脊柱外科，長(zhǎng)春 132021)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)是一組以椎間盤(intervertebral disc，IVD)退行性變，間盤內(nèi)纖維環(huán)破裂，髓核在切應(yīng)力作用下向內(nèi)突，進(jìn)一步壓迫神經(jīng)根或馬尾神經(jīng)而引起的以神經(jīng)癥狀為主的臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病[1]。新近的流行病學(xué)研究提示，在亞洲人群中，LDH的年總發(fā)病率為15 877/10萬(wàn)(其中男性為13 181/10萬(wàn)；女性為18 588/10萬(wàn)；男女比為1.00∶1.41)。此外，每5年患者的發(fā)病率和年治療費(fèi)用分別增加7.6%和14.7%。年齡矯正后的報(bào)道提示，LDH發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，75～79歲人群發(fā)病率高達(dá)42.6%。其中，年齡大于65歲患者占31.0%，且其所占醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)40.1%[2-3]。

正常的IVD內(nèi)，由于髓核包含蛋白聚糖在內(nèi)的親水性物質(zhì)，能夠?qū)⑺韬宋镔|(zhì)包裹在水分子中可加固其物理穩(wěn)定性，同時(shí)可產(chǎn)生一定的黏彈性將IVD內(nèi)的軸向載荷轉(zhuǎn)換成環(huán)向應(yīng)力，并由周圍的致密結(jié)締組織包裹，保證其結(jié)構(gòu)完整性，并提供了獨(dú)特的承受高壓的能力，極大地緩沖了對(duì)錐體、纖維環(huán)外組織及椎管內(nèi)神經(jīng)的擠壓作用力。反復(fù)長(zhǎng)期磨損及其他營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的作用下，IVD開(kāi)始退化，失去髓核的保護(hù)作用，一方面可促使錐體壓縮載荷和這些力縱向傳遞到椎體的軟骨終板上，并徑向地傳遞到周圍的肌肉組織、神經(jīng)及血管；此外，不均勻的壓力施加在椎骨上，相關(guān)結(jié)構(gòu)變化可導(dǎo)致不穩(wěn)定脊柱節(jié)段的適應(yīng)性重塑，并形成骨贅骨刺，加重關(guān)節(jié)平面不平衡及損傷[3]。另一方面，髓核慢性脫出時(shí)可進(jìn)一步刺激脊柱韌帶的肥大和骨化，伴有毛細(xì)血管增生和結(jié)締組織的浸潤(rùn)，促使椎盤軟組織的空間更加狹窄[3]。

分子機(jī)制方面，既往研究提示，慢性脊髓壓迫會(huì)導(dǎo)致慢性脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)血流量減少，同時(shí)慢性缺血會(huì)激活獨(dú)特的免疫反應(yīng)， M1和M2巨噬細(xì)胞會(huì)在壓縮部位聚集，進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和血脊髓屏障破壞，同時(shí)部分脊髓缺血后可增加髓內(nèi)壓力，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失、脫髓鞘，進(jìn)一步促使小血管扁平化而導(dǎo)致的血供減少。新近的觀點(diǎn)認(rèn)為，LDH的疾病進(jìn)展是由環(huán)境和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素共同決定的，不同基因型和環(huán)境因素之間的相互作用機(jī)制也不盡不同。MARTIROSYAN等[4]綜述LDH的發(fā)生、發(fā)展與基因的關(guān)聯(lián)，認(rèn)為遺傳因素和環(huán)境誘導(dǎo)的基因改變占IVD病因的75%，特別是在炎性、降解性、穩(wěn)態(tài)和結(jié)構(gòu)系統(tǒng)多樣性。ZHANG等[5]對(duì)128例LDH患者和132例年齡和性別匹配的健康人進(jìn)行對(duì)照研究，利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離及快速質(zhì)譜分析技術(shù)分析了3個(gè)基因中9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)FasL-844C/T(rs763110)和CASP9-1263A>G(rs4645978)兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與LDH密切相關(guān)，揭示其可能是LDH的潛在風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。PERERA等[6]評(píng)估慢性腰痛患者LDH候選基因的單核苷酸多態(tài)性(SNV)與LDH嚴(yán)重程度的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)的核苷酸多態(tài)性如rs2272023、rs35430524、rs2882676、rs2351491、rs938609、rs3825994、rs1042630、rs698621和rs3817428與LDH嚴(yán)重程度密切相關(guān)。此外，KURZAWSKI等[7]認(rèn)為電壓門控鈉通道Nav1.7相關(guān)調(diào)控亞基(sodium channel,voltage-gated,type Ⅸ,alpha subunit,SCN9A)rs676030多態(tài)性可能與癥狀性椎間盤突出癥患者的疼痛強(qiáng)度有關(guān)[7]； SADOWSKA等[8]發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素(IL)-15基因表達(dá)與LDH患者年齡相關(guān)，α1干擾素(IFNα1)、IL-6、IL-15、瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道6(transient receptor potential cation channel-6，TrPC6)基因表達(dá)與IVD退變等級(jí)密切相關(guān)[8]。

近年來(lái)，隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)的推進(jìn)，IDH疾病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因在已知風(fēng)險(xiǎn)基因中被重新鑒定出來(lái)。這些研究不僅提高對(duì)IVDD各種病理生理學(xué)要素背后眾多遺傳變異的認(rèn)識(shí)，同時(shí)有助于推進(jìn)IDH患者的個(gè)性化治療和藥物治療策略。然而，整體而言，IDH病因復(fù)雜且具體機(jī)制尚未探明，進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析有助于對(duì)該疾病有更加深入的認(rèn)識(shí)，以及進(jìn)一步地解決多維度的科學(xué)問(wèn)題。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取與預(yù)處理

1.1.1數(shù)據(jù)獲取 經(jīng)檢索，本課題組從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO，網(wǎng)址為http://ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載得到GSE23130、GSE17077和GSE15227 3組芯片的原始數(shù)據(jù)[9]，共得到57個(gè)樣品，其中對(duì)照組35個(gè)(輕度退化)，試驗(yàn)組22個(gè)(嚴(yán)重退化)[10]。所有的芯片組織來(lái)自LDH患者的IVD組織，組織分類均采用Thompson分級(jí)方法(嚴(yán)重退化的為Thompson等級(jí)Ⅳ和Ⅴ級(jí)；輕度退化的為Ⅰ～Ⅲ級(jí))。同時(shí)，通過(guò)匹配3組芯片對(duì)應(yīng)的平臺(tái)注釋文件(GPL1352[U133_X3P] Affymetrix Human X3P Array；Affymetrix,Santa Clara,CA)，對(duì)探針號(hào)進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換，有利于鑒別出合適的基因。

1.1.2數(shù)據(jù)預(yù)處理 本研究利用Affy函數(shù)讀取芯片的原始表達(dá)值、穩(wěn)健多陣列平均值法(robust multi-array average，RMA)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化、K-鄰近值法(k-nearest-neighbor，KNN)填補(bǔ)缺失值等處理[11]。其中，RMA是一種用于從Affymetrix數(shù)據(jù)創(chuàng)建表達(dá)式矩陣的算法，主要原理包括：(1)對(duì)原始強(qiáng)度值背景校正、log2變換；(2)分位數(shù)歸一化；(3)對(duì)歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，以獲得每個(gè)陣列上的每個(gè)探針集的表達(dá)式值[11]。KNN算法是機(jī)器學(xué)習(xí)中常用的經(jīng)典算法之一，其處理缺失值原理是：當(dāng)?shù)趍行、第n列數(shù)據(jù)缺失，則選取和基因m相似、第n個(gè)樣品數(shù)據(jù)完好的k個(gè)基因的第n個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行替代[12]。最后，對(duì)于多個(gè)探針對(duì)應(yīng)一個(gè)基因名的表達(dá)矩陣，課題組選取平均值作為基因表達(dá)值，而一個(gè)探針對(duì)應(yīng)多個(gè)基因名的數(shù)據(jù)將進(jìn)行刪減。

1.2方法

1.2.1差異基因分析 通過(guò)Combat函數(shù)對(duì)3組芯片的表達(dá)值進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，消除因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)偏移和批次效應(yīng)[13]。同時(shí)，利用主成分分析(principal component analysis，PCA)對(duì)Combat前后的表達(dá)值進(jìn)行可視化分析，觀察數(shù)據(jù)整體分布情況。最后，利用LIMMA差異表達(dá)分析對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組芯片表達(dá)值進(jìn)行差異評(píng)估[11]。其中，刪除批效應(yīng)可以減少對(duì)數(shù)據(jù)本身的依賴性、降低分析的錯(cuò)誤率，并提高可重復(fù)性；而LIMMA函數(shù)是經(jīng)典的差異分析方法，基于線性模型來(lái)分析設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)表達(dá)差異，主要應(yīng)用于芯片微陣列、RNA seq、定量PCR和許多蛋白質(zhì)技術(shù)產(chǎn)生的高維度數(shù)據(jù)。

接下來(lái)，利用Benjamini-Hochberg方法對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)矯正，并進(jìn)一步推算基因表達(dá)倍數(shù)(genes expressional fold-changes，F(xiàn)C)[12]。本次研究設(shè)定|log2 FC|>2且FDR矯正后P<0.05作為篩選表達(dá)差異基因的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2差異基因的生物學(xué)功能分析 利用DAVID在線分析軟件(DAVID database；http://david.abcc.ncifcrf.gov/)進(jìn)一步分析了基因本體(gene ontology，GO)功能和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路信息[14]。DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)是國(guó)際上權(quán)威的集基因注釋、可視化和集成探索的功能數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于整合探索基因通路和功能富集程度。一般認(rèn)為富集P<0.05的GO功能和KEGG通路為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因富集功能和通路。

1.2.3基于差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 導(dǎo)出差異基因后，課題組基于STRING在線分析軟件 (V10.5;http://string-db.org/)對(duì)基因進(jìn)行了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)分析[15]。STRING平臺(tái)整合了現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)論、數(shù)據(jù)庫(kù)、文本挖掘庫(kù)、基因表達(dá)庫(kù)、基因連接數(shù)據(jù)、基因融合及基因共表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)等信息，是目前權(quán)威的蛋白功能預(yù)測(cè)工具。此外，本次研究還通過(guò)Cytoscape軟件(V3.5.1;http://cytoscape.org/)對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化及關(guān)鍵基因篩選分析。

2 結(jié) 果

2.1差異表達(dá)分析結(jié)果 基于前述方法，3組芯片57個(gè)樣品(對(duì)照組35個(gè)，試驗(yàn)組22個(gè))進(jìn)行RMA背景矯正、歸一化處理、KNN算法處理缺失值、Combat函數(shù)去除批次效應(yīng)后共篩選出149個(gè)差異表達(dá)基因同時(shí)滿足|log2 FC|>2(即表達(dá)值差異大于4倍)及FDR矯正后的P<0.05的選擇標(biāo)準(zhǔn)。利用PCA分析可視化3組芯片整合過(guò)程中去除批次效應(yīng)前后的數(shù)據(jù)分組情況，見(jiàn)圖1。圖1A示3組芯片數(shù)據(jù)分布較散亂，同一組不同芯片之間數(shù)據(jù)距離比較大；而圖1B示在去除批次效應(yīng)后芯片間數(shù)據(jù)相對(duì)集中，有利于后續(xù)分析。圖2的熱圖展現(xiàn)了差異前50 的基因表達(dá)值的情況，顏色深淺差異代表了表達(dá)值的差異。

A：去除異質(zhì)性前；B：去除異質(zhì)性后

圖1 PCA顯示Combat函數(shù)去除批次效應(yīng)前后的3組芯片的整體數(shù)據(jù)分布

上欄顏色：分組信息；綠色：對(duì)照組；黃色：試驗(yàn)組；熱圖每一小格的顏色：表達(dá)值；藍(lán)色：低表達(dá)；紅色：高表達(dá)

圖2 差異基因的表達(dá)熱圖

2.2差異基因生物學(xué)功能分析 通過(guò)DAVID生物在線分析平臺(tái)，此次研究進(jìn)一步分析了差異基因的最顯著的GO功能和KEGG通路。其中，GO功能主要包括生物學(xué)進(jìn)程(Biological processes,BP)、細(xì)胞組成(cellular components，CC)、分子功能(molecular functions，MF)3個(gè)主要方面。BP功能方面，篩選的差異基因主要與GO:0006614～SRP依賴的膜翻譯蛋白(富集數(shù)目13，P=5.84×10-12)、GO:0000184～核轉(zhuǎn)錄的mRNA分解過(guò)程(富集數(shù)目13，P=9.89×10-11)及GO:0006413～翻譯起始(富集數(shù)目13，P=5.17×10-10)等功能密切相關(guān)。CC功能方面，差異基因主要與GO:0070062～細(xì)胞外泌體(富集數(shù)目59，P=2.36×10-14)、GO:0022625～胞漿大核糖體亞基(富集數(shù)目9，P=3.97×10-8)、GO:0031012～細(xì)胞外基質(zhì)(富集數(shù)目15，P=4.72×10-8)等密切相關(guān)。而在MF方面則主要與GO:0003735～核糖體的結(jié)構(gòu)組成(富集數(shù)目13，P=9.49×10-8)、GO:0008137～NADH脫氫酶(泛醌)活性(富集數(shù)目22，P=7.96×10-5)及GO:0046961～質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性、旋轉(zhuǎn)機(jī)制(富集數(shù)目4，P=0.005 4)等相關(guān)。差異基因本體功能的可視化結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖形形狀：代表不同的功能類型(圓形：基因的生物學(xué)進(jìn)程，三角形：細(xì)胞學(xué)組成，正方形：分子功能)；圖形大?。捍砀患虻臄?shù)目；圖形顏色：代表富集的統(tǒng)計(jì)值，轉(zhuǎn)換為負(fù)log10的P值進(jìn)行繪圖

圖3 基因本體功能分析結(jié)果

A：KEGG通路富集分析結(jié)果；圖形形狀：代表不同的功能類型(圓形：基因的生物學(xué)進(jìn)程，三角形：細(xì)胞學(xué)組成，正方形：分子功能)；圖形大?。捍砀患虻臄?shù)目；圖形顏色：代表富集的統(tǒng)計(jì)值，轉(zhuǎn)換為負(fù)log10的P值進(jìn)行繪圖；B：差異基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果；基因名字體大?。捍砭W(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵度的大小

圖4 KEGG通路富集分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

KEGG通路方面，主要與HSA03010：核糖體轉(zhuǎn)錄翻譯活動(dòng)(富集數(shù)目13，P=8.34×10-9)、HSA000 190：氧化磷酸化(富集數(shù)目12，P=7.30×10-8)、HSA045 12:ECM受體相互作用(富集數(shù)目10，P=1.20×10-4)、HSA04060：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(富集數(shù)目8，P=0.001 5)、HSA04370:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路(富集數(shù)目7，P=0.041)、 HSA01100：代謝途徑(富集數(shù)目20，P=0.033)及HSA04140:自噬的調(diào)節(jié)(富集數(shù)目3，P=0.048)等明顯相關(guān)。KEGG通路富集結(jié)果見(jiàn)圖4A。

2.3差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件分析的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，課題組基于網(wǎng)絡(luò)連接度大小篩選出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。其中，在此PPI網(wǎng)絡(luò)中，泛素-A 52殘基核糖體蛋白融合產(chǎn)物1(ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1，UBA52；核心緊密度：0.40；相關(guān)度：22)、大核糖體蛋白-P0(large ribosomal protein P0，RPLP0；核心緊密度：0.40；相關(guān)度：18)、核糖體蛋白L3(ribosomal protein L3，RPL3；核心緊密度：0.38；相關(guān)度：17)、大核糖體蛋白P2(large ribosomal protein P2，RPLP2；核心緊密度：0.37；相關(guān)度：16)、核糖體蛋白L27(ribosomal protein L27，RPL27；核心緊密度：0.40；相關(guān)度：16)等基因在網(wǎng)絡(luò)中具有較高的連接度，被認(rèn)為是LDH疾病差異基因網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因。差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4B。

3 討 論

LDH是一種復(fù)雜的脊柱疾病，具有高致殘率，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。本文通過(guò)多芯片整合分析，通過(guò)Thompson分級(jí)將IVD分為試驗(yàn)組(Ⅳ～Ⅴ級(jí))和對(duì)照組(Ⅰ～Ⅲ級(jí))，利用RMA、KNN算法對(duì)原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行背景化和歸一化處理、Combat函數(shù)去除3組芯片間的異質(zhì)性、LIMMA函數(shù)篩選差異基因等一系列嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理流程。多芯片整合分析結(jié)果提示，HSA03010：核糖體轉(zhuǎn)錄翻譯、HSA000 190：氧化磷酸化、HSA045 12:ECM受體相互作用等通路及UBA52、RPLP0、RPL3、RPLP2、RPL27等核糖體相關(guān)樞紐基因被認(rèn)為是LDH疾病發(fā)生、發(fā)展的重要通路及調(diào)控因子。

本研究提示，核糖體活動(dòng)及相關(guān)基因可能是LDH疾病進(jìn)展的重要調(diào)控介質(zhì)。然而，其具體機(jī)制尚不明確。KOBAYASHI等[16]通過(guò)構(gòu)建機(jī)械壓迫神經(jīng)根的體內(nèi)模型觀察神經(jīng)根壓迫引起的軸突血流紊亂在腰椎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的作用。此研究中，在壓迫開(kāi)始1周后脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元出現(xiàn)中央染色質(zhì)溶解，3周后出現(xiàn)腹角神經(jīng)元凋亡；同時(shí)，作者觀察到在此過(guò)程中核糖體參與了明顯的病理活動(dòng)，可能與LDH或腰椎管狹窄癥引起的神經(jīng)根壓迫時(shí)產(chǎn)生的軸突反應(yīng)延伸到脊髓內(nèi)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，而導(dǎo)致神經(jīng)元染色質(zhì)溶解和細(xì)胞死亡有關(guān)。同樣，ALAMIN等[17]利用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)靶向16S核糖體RNA基因，然后用擴(kuò)增子測(cè)序分析切除的IVD組織，發(fā)現(xiàn)在慢性疼痛的LDH組織中核糖體基因表達(dá)明珠增高，而這些改變與研究前期發(fā)現(xiàn)的低毒力微生物感染無(wú)關(guān)。那么，為何核糖體在LDH疾病占據(jù)如此重的作用呢？SLOMNICKI等[18]新近的研究提示，在神經(jīng)元損傷初期，為了保護(hù)核仁在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控地位不破壞核仁完整性、細(xì)胞存活和對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的信號(hào)應(yīng)答，神經(jīng)元內(nèi)將通過(guò)降低核糖體含量、RNA應(yīng)激及核糖體本身的募集而減少蛋白質(zhì)合成。然而，在損傷末期，當(dāng)核糖體蛋白從樹(shù)突的神經(jīng)元中耗盡時(shí)則需要強(qiáng)健的核糖體來(lái)支持樹(shù)突生長(zhǎng)和維持蛋白質(zhì)合成。因此，SLOMNICKI等[18]也認(rèn)為RNA應(yīng)激顆粒形成及神經(jīng)元樹(shù)突狀損傷是神經(jīng)退行性疾病的早期表現(xiàn)，通過(guò)干擾核糖體穩(wěn)態(tài)可能啟動(dòng)或放大神經(jīng)變性相關(guān)聯(lián)的回路。POIROT等[19]認(rèn)為隨著神經(jīng)元的延伸，核糖體蛋白將形成復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，并且通過(guò)微界面進(jìn)行進(jìn)一步的通信。在此過(guò)程中，在類似于“分子突觸”相互作用的神經(jīng)元中，核糖體蛋白形成了一個(gè)與簡(jiǎn)單的腦類似的分子網(wǎng)絡(luò)，部分核糖體表面蛋白被認(rèn)為是支配功能性核糖體的調(diào)控位點(diǎn)，通過(guò)“蛋白間交流”連接成合適的循環(huán)網(wǎng)絡(luò)來(lái)協(xié)調(diào)復(fù)雜的大分子運(yùn)動(dòng)和翻譯過(guò)程，并為信息傳遞和處理開(kāi)辟了新的視角[19]。在樞紐基因中，RPL3屬于核糖體相關(guān)的功能大亞基核心蛋白，主要與RNA-蛋白質(zhì)相互作用使rRNA形成其功能上正確的構(gòu)象，從而參與核糖體不同功能區(qū)域之間及核糖體和細(xì)胞因子之間的通信等密切相關(guān)[20]。編碼基因UBA52不僅是泛素庫(kù)的泛素供體，而且也是核糖體蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)器。其中，UBA52 N端含有泛素的融合蛋白和C末端的核糖體蛋白L40 (ribosomal protein L40，RPL40)結(jié)合參與了核糖體泛素化修飾[21]。然而，ARTERO-CASTRO等[22]認(rèn)為RPLP0和RPLP2不僅與核糖體活動(dòng)相關(guān)還可能參與活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累及對(duì)應(yīng)的絲裂原活化蛋白激酶1/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(MAPK1/Erk2)信號(hào)通路激活，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞的自噬等密切相關(guān)。核糖體蛋白基因RPL27進(jìn)化過(guò)程中保存良好，相對(duì)保守且與維持核糖體蛋白的特異性3D結(jié)構(gòu)相關(guān)[22]。

在氧化應(yīng)激方面，XIAO等[23]認(rèn)為氧化應(yīng)激反應(yīng)在LDH疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的再生，增加突出IVD的新生膠原和聚集蛋白聚糖含量，而抑制組織氧化磷酸化水平可明顯改善LDH，從而促進(jìn)IVD突出后IVD高度的恢復(fù)。CHANG等[24]認(rèn)為術(shù)前術(shù)后降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平將明顯改善LDH患者的手術(shù)效果和病情。在ECM相互作用方面，GUTERL等[25]認(rèn)為ECM參與了LDH的纖維化基質(zhì)形成，且參與椎體、IVD組織三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)，改變相應(yīng)的機(jī)械性能，可能是LDH疼痛的根本原因。同樣，HIROSE等[26]的研究也證實(shí)IVD的ECM代謝及重塑在LDH的病因和發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。

基于多芯片整合分析，本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)還是通路富集分析結(jié)果中均提示核糖體活動(dòng)或相關(guān)樞紐基因(包括UBA52、RPLP0、RPL3、RPLP2、RPL27等核糖體相關(guān)基因)與LDH疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，機(jī)制方面擬參與疾病所致的神經(jīng)損傷的病理過(guò)程。此外，氧化應(yīng)激和ECM相互作用通路也同樣顯著富集于LDH疾病的差異表達(dá)基因中，可能與聚集蛋白聚糖代謝、膠原形成及纖維化重構(gòu)密切相關(guān)。然而，本研究尚且缺乏實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證且LDH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在具體的機(jī)制方面也將有待于后續(xù)的深入研究。