冠心病患者血清miR-34a和HIF-1α水平與冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的相關(guān)性研究

仉慧穎,耿 威

(大慶油田總醫(yī)院：1.無創(chuàng)檢查科；2.消化內(nèi)科，黑龍江大慶 163316)

冠心病是由于冠狀動脈功能性改變或器質(zhì)性病變引起的冠狀動脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，是一種常見的心血管疾病，嚴重威脅人們身體健康，半個世紀以來發(fā)病率不斷增加[1]，主要表現(xiàn)為心絞痛、心律失常、心力衰竭[2]。冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成一般在冠狀動脈高度狹窄之后，有助于改善心肌供血不足的狀況[3]。研究表明，微小RNA-34a(miR-34a)與血管形成密切相關(guān)[4]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)是缺氧情況下誘導(dǎo)生成的轉(zhuǎn)錄因子，有研究表明，其與血管生成密切相關(guān)[5]，且HIF-1α是miR-34a的靶基因之一[6]。因此本研究通過觀察miR-34a、HIF-1α在冠狀動脈側(cè)支循環(huán)患者血清中表達差異，探討血管miR-34a、HIF-1α表達水平與冠心病患者冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的相關(guān)性，以期為冠心病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年6月至2018年9月本院收治的98例冠心病患者為冠心病組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；經(jīng)冠狀動脈造影檢查存在右冠狀動脈單支、左前降支、左回旋支血管狹窄，狹窄程度大于或等于90%。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院24 h內(nèi)死亡；合并冠狀動脈心肌橋、急性心肌梗死、惡性腫瘤；經(jīng)皮冠狀動脈介入治療；多臟器受損、腦血管疾病。根據(jù)Rentrop分級系統(tǒng)評估，冠狀動脈側(cè)支循環(huán)程度將患者分為側(cè)支形成組和側(cè)支未形成組。Rentrops分級：0級代表無側(cè)支循環(huán)；1級為分支動脈充盈，但主要的心外膜動脈未充盈；2級為心外膜動脈出現(xiàn)且只有部分充盈；3級為心外膜動脈出現(xiàn)且完全被充盈[8]。2、3級患者為側(cè)支形成組共52例，其中男24例，女28例，年齡42～78歲，平均(56.28±9.12)歲。0、1級患者為側(cè)支未形成組共46例，其中男22例，女24例，年齡44～79歲，平均(57.94±7.94)歲。另選取同期體檢健康者58例作為對照組，男30例，女28例，年齡43～80歲，平均(58.12±8.64)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1血液采集 冠心病患者入院12 h內(nèi)，健康對照組于晨起空腹采取靜脈血5 mL置于EP管內(nèi)，-4 ℃，3 000 r/min離心20 min，小心吸取上清液置于另一個EP管內(nèi)，-80 ℃冰箱保存，避免多次凍融。

1.2.2qRT-PCR法檢測 按照Trizol試劑盒操作說明書提取血清總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒Superscript Ⅲ將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Real Master Mix試劑盒并利用SYBR Green Ⅰ染料進行實時熒光定量PCR檢測血清miR-34a表達水平，程序設(shè)定為95 ℃ 預(yù)熱30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對所得數(shù)據(jù)Ct值進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-34a相對表達量。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附免疫試驗(ELISA)檢測 采用ELISA檢測血清HIF-1α水平，試劑盒為人HIF-1α酶免檢測試劑盒(江萊生物技術(shù)有限公司)，嚴格按照產(chǎn)品操作說明書進行。

表1 qRT-PCR引物序列設(shè)計

表2 3組一般資料比較

2 結(jié) 果

2.1一般資料比較 3組研究對象性別、年齡、BMI、膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、有無吸煙史、飲酒史等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.23組血清miR-34a和HIF-1α水平比較 3組血清miR-34a、HIF-1α水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，側(cè)支未形成組血清miR-34a水平無明顯變化(P>0.05)、血清HIF-1α水平明顯升高(P<0.05)；側(cè)支形成組血清miR-34a水平明顯降低(P<0.05)，血清HIF-1α水平明顯升高(P<0.05)。與側(cè)支未形成組相比，側(cè)支形成組血清miR-34a水平明顯降低(P<0.05)，血清HIF-1α水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

2.3血清miR-34a、HIF-1α水平對冠狀動脈側(cè)支形成的診斷價值 ROC曲線顯示，血清miR-34a水平預(yù)測冠心病患者發(fā)生冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成曲線下面積為0.895，截斷值為0.56，敏感度為90.4%，特異度為84.8%。血清HIF-1α水平預(yù)測冠心病患者發(fā)生冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的曲線下面積為0.909，截斷值為21.38 ng/mL，敏感度為91.3%，特異度為90.4%，見圖1。

2.4冠心病患者側(cè)支循環(huán)形成的影響因素分析 以是否發(fā)生側(cè)支循環(huán)形成為因變量，以年齡、BMI、TC、TG、miR-34a、HIF-1α為自變量并進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示miR-34a、年齡是側(cè)支循環(huán)形成的保護因素，HIF-1α、TG是側(cè)支循環(huán)形成的危險因素，見表4。

表3 血清miR-34a和HIF-1α水平表達情況

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與側(cè)支未形成組比較

圖1 血清miR-34a(A)、HIF-1α(B)水平對冠狀動脈側(cè)支形成的診斷價值

表4 多因素Logistic回歸分析

3 討 論

冠心病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變引起的管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病。側(cè)支循環(huán)的形成有助于改善冠心病患者心肌缺血的癥狀。miRNA是一類由22個左右的核苷酸組成內(nèi)源性非編碼RNA，性質(zhì)較穩(wěn)定，不受性別、年齡等一般情況影響，在心血管疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[9]。有研究表明，miR-34a參與心血管疾病的發(fā)病過程[4]。另有研究表明HIF-1α與血管生成密切相關(guān)[5]，且HIF-1α是miR-34a的靶基因[6]，因此本研究主要探討血清miR-34a、HIF-1α水平與冠心病患者側(cè)支循環(huán)形成的關(guān)系。

側(cè)支循環(huán)的建立可有效緩解心肌缺血狀態(tài)，對控制心絞痛發(fā)作、減少心肌梗死范圍、降低室壁瘤發(fā)生風(fēng)險、改善患者預(yù)后具有重要意義。研究表明，側(cè)支循環(huán)的建立受冠狀動脈狹窄程度的影響，但與病變支數(shù)無關(guān)[10]。TABUCHI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血內(nèi)皮祖細胞中miR-34a水平明顯高于非冠心病患者，miR-34a水平與內(nèi)皮祖細胞數(shù)量呈負相關(guān)，而內(nèi)皮祖細胞在血管修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[12]。據(jù)此推測，miR-34a在冠心病患者中可能發(fā)揮抑制血管新生的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的冠心病患者血清miR-34a水平明顯低于冠狀動脈側(cè)支循環(huán)未形成患者，提示miR-34a在冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成過程中發(fā)揮重要作用。血清miR-34a判定冠心病患者側(cè)支循環(huán)形成的曲線下面積為0.895，敏感度、特異度均大于80%，提示血清miR-34a可作為判斷側(cè)支循環(huán)建立的指標(biāo)，截斷值為0.56，提示當(dāng)血清miR-34a水平低于0.56時，側(cè)支循環(huán)形成的可能性較大。Logistic回歸分析也顯示血清miR-34a低表達是冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的保護因素。

HIF-1α在缺氧條件下表達明顯增加，轉(zhuǎn)至細胞核，啟動多種基因表達，誘導(dǎo)新生血管生成。此外，白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α也可誘導(dǎo)HIF-1α生成[13-16]。本研究中，冠心病患者(側(cè)支形成組、側(cè)支未形成組)血清HIF-1α均高于健康人，提示可能是心肌缺血、缺氧、炎癥共同促進HIF-1α水平升高。BULYSHEVA等[17]研究表明，HIF-1α過表達豬心肌梗死區(qū)域新生血管條數(shù)高于正常豬。本研究中，側(cè)支循環(huán)形成患者血清HIF-1α水平明顯高于側(cè)支循環(huán)未形成患者，提示血清中高水平HIF-1α可能促進冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成。LIN等[18]研究表明，HIF-1α是miR-34a的靶基因，miR-34a可通過負調(diào)控HIF-1α表達，參與糖尿病相關(guān)耳蝸毛細胞凋亡，猜測在冠心病患者中，miR-34a也可能調(diào)控HIF-1α表達參與冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成過程，但本研究未對miR-34a、HIF-1α關(guān)系做研究，還有待進一步驗證。本研究ROC曲線顯示，血清HIF-1α水平預(yù)測冠心病患者側(cè)支循環(huán)形成的曲線下面積為0.909，敏感度和特異度均高于90%，截斷值為21.38 ng/mL，提示當(dāng)血清HIF-1α水平高于21.38 ng/mL時，側(cè)支循環(huán)形成的可能性較大。此外Logistic回歸分析也顯示血清HIF-1α低水平是冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的危險因素，提示高水平HIF-1α有助于冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成，改善心肌缺血。

綜上所述，冠心病患者側(cè)支循環(huán)形成者血清miR-34a水平降低，血清HIF-1α水平升高，檢測血清miR-34a、HIF-1α水平有助于預(yù)測冠心病患者側(cè)支循環(huán)形成情況，從而合理用藥。本研究也存在一定不足，miR-34a如何調(diào)控HIF-1α參與側(cè)支循環(huán)的具體機制還有待進一步研究。此外，本研究樣本數(shù)過少，后續(xù)需進行大樣本、多中心實驗進一步證實。