二甲雙胍對(duì)博來霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的影響*

簡(jiǎn)悅，趙勇，江洪艷，王先梅，伍義蘭，劉洪艷

（1.遵義市第一人民醫(yī)院 呼吸科，貴州 遵義 563002；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸一科，貴州 遵義 563000）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種原因不明的慢性進(jìn)行性肺間質(zhì)纖維化性疾病，多預(yù)后不良。IPF 好發(fā)于老年患者，50 歲以下人群罕見，男性發(fā)病率高于女性，一般生存期為確診后的2 ～3年，發(fā)病率6.8 ～16.3 人/10 萬。在1991 ～2003年間IPF 的發(fā)病率每年上升約11%，且IPF 發(fā)病率和患病率仍在持續(xù)增加[1]，因此尋找IPF 合適的治療方法迫在眉睫。SUN 等[2]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能減少肺纖維化模型小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor- beta,TGF-β）、膠原蛋白的產(chǎn)生，使支氣管周圍膠原沉積減少，從而抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，且本實(shí)驗(yàn)前期已證明二甲雙胍對(duì)于早期肺纖維化（7 d）有一定的治療效果，故本實(shí)驗(yàn)探討對(duì)中晚期肺纖維化的治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、動(dòng)物與試劑

電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），高壓蒸汽滅菌器（日本TOMY 公司），純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司），酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司），手持超聲勻漿機(jī)（日本Sanyo 公司），微量可調(diào)節(jié)移液器、IP Win32 采圖系統(tǒng)DM4000B（德國Eppendorf 公司），Germany 光學(xué)顯微鏡NIKON ＆ ys100（德國Leica 公司），冷凍臺(tái)式離心機(jī)（美國Eppendorf 公司），石蠟包埋機(jī)（銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），-20℃低溫冰箱、-80℃超低溫冰箱（日本Sanyo 公司），37℃孵箱（美國HIRASMWA 公司）。SD 雄性大鼠44 只，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，寄養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

Masson 染色劑、HE 染色劑（北京誠林生物科技有限公司），二甲雙胍片（中美上海施寶制藥有限公司），吡非尼酮（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司），潑尼松（浙江仙據(jù)制藥有限公司），博來霉素（浙江海正輝瑞制藥有限公司），大鼠TGF-β 及HYP 酶聯(lián)免疫試劑盒（貴州晟瑞達(dá)生物科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物模型的復(fù)制及分組

空白對(duì)照組（4 只）大鼠氣管注射生理鹽水1 ml/kg。 成功復(fù)制模型的24 只大鼠隨機(jī)分為4 組，每組6只。模型組、二甲雙胍組、潑尼松組、吡非尼酮組大鼠氣管內(nèi)單次注入博來霉素5 mg/kg（按5 mg/ml 溶于生理鹽水）復(fù)制肺纖維化模型。于模型復(fù)制后第15 天起據(jù)體重予以每日灌服相應(yīng)藥物（其中空白對(duì)照組和模型組為生理鹽水5 ml/kg，其余各組分別予以：二甲雙胍250 mg/kg、潑尼松5 mg/kg、吡非尼酮50 mg/kg，每間隔24 h 給藥1 次，用藥14 d 后處死大鼠并取材）。

通過ELISA 雙抗體夾心法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中TGF-β 的含量及肺組織勻漿液中羥脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）的含量。并取肺組織行Masson 染色及HE 染色以觀察大鼠肺組織病理變化。

1.3 標(biāo)本的收集

BALF 收集及制備：將采血完畢的大鼠，沿前正中線剪開頸部和胸腔，用手術(shù)線結(jié)扎右主支氣管。然后用組織剪在頸部氣管遠(yuǎn)心端處剪開一小口，并插入去掉針芯的留置針軟管，用絲線結(jié)扎氣管防止留置針脫落，將3 ml 生理鹽水緩慢注入氣管，然后回抽，反復(fù)重復(fù)3 次，若收集BALF 占原液的60%以上算合格，將收集的BALF 離心（3 000 r/min，20 min，4℃），收集上清液分裝于EP 管中，置于-80℃冰箱冷凍保存待用。

肺組織采集及勻漿液制備：將結(jié)扎的右肺切除，取右肺上葉和/或中葉用生理鹽水沖洗表面血液，然后用濾紙吸干。取出少量肺組織稱取重量，置于9 倍重量的生理鹽水中，用眼科剪剪碎肺組織，后用超聲勻漿機(jī)將肺組織充分勻漿（整個(gè)過程都需低溫進(jìn)行），在4℃、3 000 r/min 離心20 min，收集上清液分裝于EP 管中待檢測(cè)或存于-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.4 肺組織病理檢查

肺組織病理標(biāo)本的制備：取右肺下葉（若肺組織較小可加采集右肺中葉）并固定于10%多聚甲醛中。由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科行HE 染色、Masson 染色（嚴(yán)格按說明書執(zhí)行）。病理結(jié)果評(píng)分：在光學(xué)顯微鏡下觀察HE、Masson 染色病理切片，采取計(jì)算機(jī)圖像分析軟件IP Win32 采圖系統(tǒng)采集圖片，放大倍數(shù)200 倍，并嚴(yán)格根據(jù)SZAPIEL 等[3]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，采取雙盲法由2 人評(píng)分并取平均數(shù)記分，其中肺泡炎癥及肺纖維化程度評(píng)分為1 級(jí)：0 分，無肺泡炎；2 級(jí)：1 分，有輕度肺泡炎和肺纖維化，局部單核細(xì)胞浸潤不到全肺20%，肺泡結(jié)構(gòu)無明顯破壞；3 級(jí)：2 分，中度肺泡炎和肺纖維化，面積約占全肺的20%～50%；4 級(jí)：3 分，重度肺泡炎和肺纖維化。面積≥全肺50%，肺泡腔內(nèi)偶有單核細(xì)胞和/或出血造成實(shí)變。

1.5 雙抗體夾心法檢測(cè)BALF 中TGF-β 及HyP的含量

①加樣。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7 孔，依次加入100 μl 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻卓准?00 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，余孔加待測(cè)樣品100 μl，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1 h。②棄去液體，甩干，不用洗滌；③每孔加檢測(cè)溶液A 工作液100 μl（臨用前配制），酶標(biāo)板覆膜，37℃溫育1 h；④棄去孔內(nèi)液體，每孔用350 μl 的洗滌液洗滌，浸泡1 ～2 min，在吸水紙上輕拍酶標(biāo)板來移除孔內(nèi)所有液體。重復(fù)洗板3 次。最后1 次洗滌后，吸取或倒出剩余的洗滌緩沖液，將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，將殘留在孔內(nèi)的液體全部吸干。此過程也可采用噴射瓶，多道移液器或自動(dòng)洗板機(jī)來完成；⑤每孔加檢測(cè)溶液B工作液（臨用前配制）100 μl，酶標(biāo)板覆膜，37℃溫育30 min；⑥棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟4；⑦每孔加TMB 底物溶液90 μl，酶標(biāo)板覆膜，37℃避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在10 ～20 min，不要超過30 min。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3 或4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3 或4 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）；⑧每孔加終止溶液50 μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻；⑨在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD）值；⑩HYP的檢測(cè)方法與TGF-β相同，具體操作步驟如上。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，用Prism 5 軟件繪圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠模型復(fù)制及用藥后死亡情況

空白對(duì)照組于灌服生理鹽水后第13 天死亡1 只，其余大鼠予以博來霉素模型復(fù)制后14 d 內(nèi)間斷出現(xiàn)死亡，死亡的大鼠主要集中在模型復(fù)制后前5 d 15 只。各組大鼠在予以相應(yīng)藥物干預(yù)期間，除模型組及潑尼松組各死亡1 只外，其余各組均無大鼠死亡。見圖1、2。

圖1 空白對(duì)照組與模型復(fù)制后大鼠存活率

圖2 各組大鼠用藥干預(yù)期間存活率

2.2 各組大鼠肺組織病理特征

光鏡下肺組織肺泡炎癥及肺纖維化程度及病理評(píng)分：空白對(duì)照組（0.250±0.289）分，模型組（2.000± 0.707）分，二甲雙胍組（0.917±0.548）分，潑尼松組（1.600±0.5478）分，吡非尼酮組（1.333±0.516）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.554，P= 0.000）；模型組高于空白對(duì)照組、二甲雙胍組、吡非尼酮組（P＜0.05），潑尼松組高于二甲雙胍組（P＜0.05）。

空白對(duì)照組：光學(xué)顯微鏡下對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整且連續(xù)，肺泡腔透亮，肺泡間隔偶可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。模型組：大鼠肺組織肺泡腔內(nèi)可見大量炎癥滲出，可見單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，可見大量肺實(shí)變。二甲雙胍組：大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡腔內(nèi)可見散在炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔稍有增寬，無明顯實(shí)變，肺血管腔內(nèi)可見充血及炎癥滲出。潑尼松組：大鼠肺組織肺泡腔可見片狀炎癥滲出，肺泡間隔明顯增寬，肺泡間隔及肺泡腔內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破環(huán)明顯。吡非尼酮組：大鼠肺組織內(nèi)可見肺泡結(jié)構(gòu)部分被破壞，肺泡壁稍有增厚，部分肺泡腔及肺泡間隔內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤及散在充血。見圖3、4。

圖3 各組大鼠肺組織病理特征 （HE ×200）

圖4 各組大鼠HE 病理評(píng)分比較 （±s）

2.3 各組大鼠Masson 染色及肺纖維化評(píng)分

空白對(duì)照組（0.125±0.250）分，模型組（2.200± 0.447）分，二甲雙胍組（1.333±0.516）分，潑尼松組（1.800±0.447）分，吡非尼酮組（1.168±0.408）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.372，P=0.000）。空白對(duì)照組：光鏡下可見大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡間隔內(nèi)未見明顯膠原沉積，在支氣管和血管周圍見少量膠原沉積；模型組：肺泡間隔明顯增寬，肺泡間隔內(nèi)可見大量膠原沉積成片狀、絮狀沉積，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔充血明顯，與空白對(duì)照組相比較（P＜0.05）；二甲雙胍組：大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡間隔內(nèi)可見散在點(diǎn)狀、絮狀膠原沉積，在終末氣管、支氣管及血管周圍纖維化病灶相對(duì)較為明顯，與模型組比較（P＜0.05）；潑尼松組：大鼠肺組織內(nèi)可見條索狀纖維化病灶，廣泛分布肺組織，其中以支氣管及血管周圍纖維化病灶尤其明顯，肺泡間隔稍有增寬伴膠原沉積明顯，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，在肺泡間隔內(nèi)可見充血明顯，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；吡非尼酮組：肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡壁稍有增厚，肺泡間隔內(nèi)可見散在線性及絮狀纖維化病灶，肺泡間隔及肺泡腔內(nèi)稍有充血水腫，在支氣管及血管周圍纖維化不明顯，與模型組和潑尼松組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；但相較于二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、6。

2.4 各組大鼠肺組織中HyP 含量比較

空白對(duì)照組（188.211±15.551）μg/ml，模型組 （285.046±17.046）μg/ml，二甲雙胍組（245.996± 10.132）μg/ml，潑尼松組（269.546±13.402）μg/ml，吡非尼酮組（230.238±11.049）μg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.999，P=0.000）。在肺組織勻漿液中模型組HYP 的含量較各組有所增高，除與潑尼松組無差異外（P＞0.05），與其余各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且二甲雙胍組相較潑尼松組（P＜0.05）；吡非尼酮組較潑尼松組有所降低（P＜0.05）。見圖7。

2.5 各組大鼠BALF 中TGF-β 含量比較

空白對(duì)照組（64.799±5.111）pg/ml，模型組（106.553±9.995）pg/ml，二甲雙胍組（85.731± 3.631）pg/ml，潑尼松組（96.751±7.912）pg/ml，吡非尼酮組（80.511±2.748）pg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.333，P=0.000）。在BALF 中模型組TGF-β 的含量較空白對(duì)照組有所增高（P＜0.05）；二甲雙胍組較模型組TGF-β 的含量有所降低（P＜0.05）；潑尼松組較模型組TGF-β的含量有所降低（P＜0.05）；吡非尼酮較模型組TGF-β的含量有所降低（P＜0.05）；二甲雙胍組相較潑尼松組有所降低（P＜0.05），但相較于吡非尼酮組較潑尼松組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖8。

圖5 各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)變化 （Masson ×200）

圖6 各組大鼠肺組織Masson 染色病理評(píng)分 （±s）

圖7 各組大鼠肺組織中HyP 含量 （±s）

圖8 各組大鼠BALF 中TGF-β 的含量 （±s）

3 討論

目前許多學(xué)者認(rèn)為，炎癥是特發(fā)性肺纖維化早期的主要作用機(jī)制之一，但較少參與中晚期特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。在前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠有效抑制由博來霉素誘導(dǎo)的早期（7 d）肺纖維化，考慮其作用機(jī)制可能是二甲雙胍通過抑制TGF-β 的分泌和HYP 的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制肺纖維化的作用。為探討二甲雙胍對(duì)中晚期肺纖維化是否有療效，且為更加符合臨床干預(yù)過程，故選擇在模型復(fù)制14 d 后予以相應(yīng)藥物干預(yù)以觀察療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二甲雙胍能夠降低由博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠死亡率。

通過HE 染色并采用SZAPIEL 等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)以了解肺部炎癥變化情況，結(jié)果顯示二甲雙胍具有一定的抗炎作用。HE 染色顯示模型組炎癥滲出明顯，而二甲雙胍組炎癥減輕，與此前許多實(shí)驗(yàn)報(bào)道二甲雙胍能減輕肺部相關(guān)疾病炎癥的結(jié)論相一致[4-5]。盡管有學(xué)者認(rèn)為在肺纖維化中晚期炎癥較少參與其中，但本實(shí)驗(yàn)通過HE 染色發(fā)現(xiàn)在模型復(fù)制28 d 后仍有炎癥細(xì)胞浸潤、滲出，且CHEN 等[6]研究也發(fā)現(xiàn)，在博來霉素模型復(fù)制42 d 后肺組織仍有炎癥表現(xiàn)，故推測(cè)在博來霉素誘導(dǎo)的中晚期肺纖維化中炎癥仍參與其中，因此二甲雙胍抗炎作用在緩解大鼠肺纖維化中也有著積極的治療作用。在本實(shí)驗(yàn)中吡非尼酮的抗炎作用可能與CHAN等[7]的研究發(fā)現(xiàn)相一致，認(rèn)為吡非尼酮抑制纖維化的機(jī)制可能是通過能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子相關(guān)，其中包括TGF-β、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、血小板衍生因子和腫瘤壞死因子等。本實(shí)驗(yàn)提示吡非尼酮的抗炎作用較二甲雙胍弱，可能為本實(shí)驗(yàn)中吡非尼酮的劑量為50 mg/kg屬于一個(gè)低劑量或是中等劑量，而有研究報(bào)道稱吡非尼酮在抗肺纖維化疾病中有藥物濃度依賴性，因此加用劑量可能會(huì)有更加積極的治療效果；其次吡非尼酮的吸收部位主要在腸道，本實(shí)驗(yàn)采用去除膠囊的吡非尼酮溶液灌胃，故而會(huì)導(dǎo)致藥物破壞增加，吸收減少。有研究發(fā)現(xiàn)，靜脈予以吡非尼酮治療效果較口服給藥效果更佳。最后也不排除本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是由取材部位及灌藥物時(shí)誤入氣管等所致。

在模型組病理提示膠原纖維在肺間質(zhì)呈片狀、團(tuán)塊狀沉積，提示模型復(fù)制成功。二甲雙胍和吡非尼酮能夠減輕由博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，其中吡非尼酮組治療效果更加明顯，但兩者之間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

眾所周知肺纖維化的病理表現(xiàn)主要為細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，當(dāng)肺膠原蛋白合成增加，降解減少時(shí)，導(dǎo)致膠原纖維增多，最終使膠原過度沉積。HYP 在膠原蛋白中約占13.4%，是膠原蛋白一種特有的氨基酸，幾乎所有HYP 都存在于膠原中，而膠原是肺纖維化時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，故HYP 水平能反映肺組織纖維化的嚴(yán)重程度[8]。

本實(shí)驗(yàn)中模型組HYP 的含量比空白對(duì)照組高，進(jìn)一步證明模型復(fù)制成功。其中二甲雙胍組及吡非尼酮組HYP 的含量比模型組低，提示二甲雙胍及吡非尼酮對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化是有一定的治療意義，而潑尼松組肺纖維化并未明顯得到改善，與目前大家認(rèn)為的激素不能改變中晚期IPF 患者的死亡率及預(yù)后相一致。

在前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠有效抑制由博來霉素誘導(dǎo)的早期肺纖維化，考慮其作用機(jī)制可能是二甲雙胍通過抑制TGF-β 的分泌和HYP 的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制肺纖維化的作用，且TGF-β 被認(rèn)為是最為關(guān)鍵的致纖維化因子，它在肺的發(fā)育過程中是一個(gè)負(fù)性調(diào)控因子。目前認(rèn)為TGF-β 通過Smad 途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附及凋亡等，從而調(diào)控肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展[7]。

進(jìn)一步檢測(cè)TGF-β，發(fā)現(xiàn)通過博來霉素模型復(fù)制后TGF-β 的含量增加，而二甲雙胍組及吡非尼酮組TGF-β 的含量降低，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，二甲雙胍及吡非尼酮通過減少TGF-β 的產(chǎn)生，從而使未成熟成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)受限，抑制了成纖維細(xì)胞遷移、增殖，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換為肌成纖維細(xì)胞發(fā)生障礙，繼而減輕膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)和肺泡間過度積聚，從而抑制肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)中二甲雙胍及吡非尼酮能減少TGF-β的產(chǎn)生，從而考慮其對(duì)肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展起著一定的調(diào)控作用。

總的來說，二甲雙胍能減少TGF-β 分泌及HYP的產(chǎn)生，對(duì)由博來霉素誘導(dǎo)的中晚期肺纖維化是有一定的療效。但是其具體作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。