液相色譜法測(cè)定注射用鹽酸博來(lái)霉素組分

陸常輝，桂王艷

（1.瀚暉制藥有限公司，浙江 杭州 310020；2.浙江海正藥業(yè)股份有限公司藥品研發(fā)QC，浙江 杭州 311404）

博來(lái)霉素為發(fā)酵來(lái)源的糖肽類(lèi)抗腫瘤抗生素類(lèi)藥物，適用于皮膚癌、頭頸部癌（上頜竇癌、咽部癌、唇癌等）、肺癌（特別是原發(fā)和轉(zhuǎn)移性磷癌）、食道癌等的治療[1]。博來(lái)霉素為多組分藥物，因此組分是藥品質(zhì)量控制中重要的項(xiàng)目之一。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)，建立了比各藥典標(biāo)準(zhǔn)更優(yōu)的博來(lái)霉素組分檢查方法。方法經(jīng)驗(yàn)證，專(zhuān)屬性、線(xiàn)性、精密度和準(zhǔn)確度等均符合要求，可保證組分檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

島津LC-20AD高效液相色譜儀，軟件LabSolutions色譜工作站；安捷倫1269高效液相色譜儀，軟件OpenLab色譜工作站；S220型pH計(jì)（METTLER TOLEDO公司），XP26型電子分析天平（METTLER TOLEDO公司）。

注射用鹽酸博來(lái)霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20BH03010、20BH03011、20BH03012）；甲醇和乙腈均為色譜純，己烷磺酸鈉為高效液相色譜專(zhuān)用試劑，乙二胺四乙酸二鈉和氨水為分析純，水為純化水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（4.6mm×150mm，3.5μm）；以己烷磺酸鈉溶液（取己烷磺酸鈉4.7g與乙二胺四醋酸二鈉1.86g，加0.08mol/L醋酸溶液使溶解并稀釋至1000ml，用氨溶液調(diào)節(jié)pH值至4.3）為流動(dòng)相A；甲醇:乙腈（70:30）為流動(dòng)相B；按表1線(xiàn)性梯度洗脫；柱溫為35℃；流速為每分鐘1.0ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；進(jìn)樣量10μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 系統(tǒng)適用性

取本品適量，加水制成每1ml約含2500博來(lái)霉素單位的溶液，量取10μl注入液相色譜儀，按表1進(jìn)行梯度洗脫。色譜圖中兩個(gè)主組分峰與各自相鄰雜質(zhì)峰的分離度不小于1.0；理論塔板數(shù)按博來(lái)霉素A2峰計(jì)算，應(yīng)不低于8000。

2.3 組分測(cè)定

取本品，加水制成每1ml約含2500博來(lái)霉素單位的溶液，搖勻，精密量取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按峰面積歸一化法計(jì)算博來(lái)霉素A2，博來(lái)霉素B2，博來(lái)霉素B4，去甲基博來(lái)霉素A2，去甲基博來(lái)霉素A2外其他雜質(zhì)之和。

3 方法學(xué)研究

3.1 專(zhuān)屬性考察

分別在1.10W/m2強(qiáng)光，0.5N鹽酸溶液，0.01N氫氧化鈉溶液，5%過(guò)氧化氫溶液，以及在40℃、75%RH條件下對(duì)樣品進(jìn)行降解。進(jìn)樣測(cè)試。

降解幅度最大的熱降解條件下樣品色譜圖見(jiàn)圖1，在擬定的色譜條件下，博來(lái)霉素的各組分及雜質(zhì)均能有效分離，方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 熱降解樣品溶液典型圖譜

3.2 檢測(cè)限和定量限

此色譜條件下，博來(lái)霉素的檢測(cè)限為0.222 μg/ml，定量限為0.739 μg/ml；去甲基博來(lái)霉素A2的檢測(cè)限為0.242 μg/ml，定量限為0.805 μg/ml；博來(lái)霉素B4的檢測(cè)限為0.227 μg/ml，定量限為0.757 μg/ml。

3.3 線(xiàn)性

配制線(xiàn)性梯度溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，博來(lái)霉素A2+博來(lái)霉素B2在定量限至2mg/ml范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性，線(xiàn)性方程為y=4.9444x-2.7221（R2=1.0000）；去甲基博來(lái)霉素A2在0.8 μg/ml～128 μg/ml內(nèi)呈良好線(xiàn)性，線(xiàn)性方程為y=4.5821x-0.8333（R2=1.0000）；博來(lái)霉素B4在0.75 μg/ml～30 μg/ml呈良好線(xiàn)性，線(xiàn)性方程為y=3.2560x-0.1221（R2=1.0000）。

3.4 準(zhǔn)確度

將已知量的組分加入博來(lái)霉素中，再按面積歸一化法測(cè)定各自的量并計(jì)算回收率。結(jié)果表明在8.051μg/ml～120.770μg/ml的加樣范圍內(nèi)，去甲基博來(lái)霉素A2的回收率范圍為92.5%～96.1%；在0.750μg/ml～30.019μg/ml的加樣范圍內(nèi)，去博來(lái)霉素B4的回收率范圍為96.4%～103.4%；在8.051μg/ml～120.770μg/ml的加樣范圍內(nèi)，去甲基博來(lái)霉素A2的回收率范圍為92.5%～96.1%；

3.5 精密度

重復(fù)性：配制6份加入雜質(zhì)的供試品溶液，測(cè)定組分及雜質(zhì)。結(jié)果顯示6份樣品溶液中博來(lái)霉素A2、博來(lái)霉素B2和博來(lái)霉素A2+博來(lái)霉素B2的RSD小于0.1%，其他總雜質(zhì)的RSD小于3.2%，重復(fù)性符合要求；

中間精密度：在不同HPLC系統(tǒng)、不同批次的色譜柱，不同實(shí)驗(yàn)人員及不同日期檢測(cè)重復(fù)性同批次樣品。并將結(jié)果于與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)比，博來(lái)霉素A2、博來(lái)霉素B2及兩者的加和的差值在0.1%～0.2%之間。去甲基博來(lái)霉素A2、博來(lái)霉素B4，及除以上雜質(zhì)外的其他雜質(zhì)的和的差值不超過(guò)0.06%。證明方法具有良好的中間精密度。

4 組分測(cè)定結(jié)果

采用以上方法測(cè)定海正藥業(yè)的三批注射用鹽酸博來(lái)霉素，博來(lái)霉素A2與博來(lái)霉素B2的和分別為95%、96%、95%；博來(lái)霉素B4均小于1%；去甲基博來(lái)霉素A2分別為1.0%、0.9%和1.2%；去甲基博來(lái)霉素A2外其他雜質(zhì)之和分別為3.6%、3.4%、3.7%。

5 討 論

對(duì)比本方法與現(xiàn)行版美國(guó)藥典[2]、英國(guó)藥典[3]和日本藥典[4]收載的博來(lái)霉素相關(guān)組分方法，本方法能檢測(cè)出更多的雜質(zhì)，有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。對(duì)比結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 不同方法組分檢測(cè)結(jié)果對(duì)比