HA/HI試驗在家禽免疫監(jiān)測中應(yīng)用的實驗教學(xué)探討

張濟培　陳濟鐺　陳建紅　司興奎

摘要：本文就紅細胞凝集（HA）與紅細胞凝集抑制（HI）試驗（微量法）在家禽新城疫等疫病免疫監(jiān)測中應(yīng)用的實驗課教學(xué)的若干方面，包括課程題目、教學(xué)目的、教學(xué)內(nèi)容、實驗用材、操作關(guān)鍵、結(jié)果判斷、誤差規(guī)避、指導(dǎo)接種、時間安排等，談?wù)勛约憾嗄陙斫谈牡奶接?、體會，以期達到改善本實驗課程教學(xué)效果，提高教學(xué)效率，貼近生產(chǎn)實際，加強生產(chǎn)指導(dǎo)作用等目的。

關(guān)鍵詞：雞新城疫;免疫監(jiān)測;實驗課;教改

中圖分類號：G642.0???? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1674-9324（2019）13-0278-03

我國嚴重危害家禽健康且病原具有血凝性的病毒性傳染病，在上世紀80年代初期之前，主要是雞新城疫[1];80年代中期至90年代初期增加了鴿瘟（又稱鴿新城疫，鴿I型副粘病毒病）、產(chǎn)蛋下降綜合征、H9亞型禽流感等[2，3]，90年代中期之后，再增加了H5亞型禽流感、H7亞型禽流感等和水禽新城疫（也有稱水禽副粘病毒病，鵝副粘病毒病，鴨副粘病毒?。?。防控上述疫病的關(guān)鍵方法之一是，實施特異免疫接種和免疫監(jiān)控。而監(jiān)控免疫效果的有效方法是HA（紅細胞凝集）與HI（紅細胞凝集抑制）試驗。HA與HI技術(shù)對于正確指導(dǎo)禽群的雞新城疫、鴿瘟、禽流感、產(chǎn)蛋下降綜合征等重要疫病的常規(guī)免疫接種、加強接種和緊急接種具有重要的作用。筆者經(jīng)常進行本技術(shù)的實驗課教學(xué)，并不斷在解決教學(xué)難點、疑點，改善教學(xué)效果、提高教學(xué)效率、貼近生產(chǎn)實際、加強生產(chǎn)指導(dǎo)作用等方面進行思考，積累了一些心得，謹陳述如下，以供參考。

一、關(guān)于本實驗課的題目

病原具有血凝性的家禽病毒性傳染病，除雞新城疫，尚有鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產(chǎn)蛋下降綜合征等。上述各種傳染病均可應(yīng)用HI試驗（微量法）進行免疫監(jiān)測，實驗術(shù)式大同小異。2004年以前，本校在進行雞新城疫免疫監(jiān)測實驗課教學(xué)過程中，穿插提及鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產(chǎn)蛋下降綜合征等的免疫監(jiān)測要點。2005年以后，本校禽病學(xué)實驗教學(xué)大綱將“雞新城疫免疫監(jiān)測”課題名稱改為“禽具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測——以新城疫免疫監(jiān)測為例”，同時在實驗指導(dǎo)書中的必要環(huán)節(jié)，提示各種疫病免疫監(jiān)測技術(shù)的不同要點，以期提高本實驗課的信息容量。實驗課題作了上述修改后，在實驗課開始時，要著意解題，講明何謂免疫監(jiān)測，具有血凝性的病毒病主要包括哪些，本試驗以何種病的免疫監(jiān)測為例等，以引起學(xué)生的注意。

二、關(guān)于本實驗課目的要求

本實驗課的目的與要求，通常只著重于“掌握雞新城疫免疫監(jiān)測的方法—紅細胞凝集試驗與紅細胞凝集抑制試驗”，這樣對于學(xué)生在獸醫(yī)專業(yè)基礎(chǔ)課上已學(xué)過的“紅細胞凝集試驗與紅細胞凝集抑制試驗”知識，未能給以明顯的提升、發(fā)展。實踐證明，僅掌握紅細胞凝集試驗與紅細胞凝集抑制試驗，尚遠遠不能滿足雞新城疫等疫病免疫監(jiān)測的目的。對于即將進入禽病防治一線工作的學(xué)生，還應(yīng)能依據(jù)免疫監(jiān)測的結(jié)果分析禽群目前的免疫狀況，指導(dǎo)相應(yīng)禽群實施進一步的免疫接種。故在本實驗課的具體指導(dǎo)過程中和實驗指導(dǎo)書內(nèi)容中，都應(yīng)注意讓學(xué)生將“依據(jù)血凝性病毒病免疫監(jiān)測的結(jié)果指導(dǎo)禽群相應(yīng)病毒病的免疫接種”作為本實驗課的重要目的之一。

三、關(guān)于實驗原理

充分了解實驗原理，對于掌控實驗整體，把握實驗關(guān)鍵，較高質(zhì)量地完成實驗內(nèi)容具有重要的作用。以往，筆者考慮到獸醫(yī)專業(yè)學(xué)生前期曾在微生物學(xué)課程學(xué)習(xí)過HA/HI反應(yīng)原理，故在上本實驗課時，僅僅簡單地帶領(lǐng)學(xué)生重溫一下：“血凝性病毒具有凝集紅細胞的能力，且該能力可以被特異抗體所抑制”。后來發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)學(xué)生對于該概念理解并不深刻，較難據(jù)此洞悉本實驗的原理，不利于提高學(xué)生在實驗操作過程的主動性，導(dǎo)致實驗教學(xué)效果大打折扣。鑒此，在近幾年的教學(xué)中，筆者設(shè)計并采用了如下的一個講授方法。

1.提問學(xué)生：“血凝性病毒具有一個重要的生物學(xué)特性是什么？”引導(dǎo)學(xué)生回憶：“①該類病毒具有血凝特性;②該血凝性可被相應(yīng)抗體所抑制”。

2.具體解釋：上述“①”的含義和反應(yīng)現(xiàn)象是：“如果在反應(yīng)孔中依次加入血凝性病毒（抗原）和家禽紅細胞，孔底將會出現(xiàn)凝集圖像，讀作‘凝集，記作‘+，此反應(yīng)稱為凝集反應(yīng)（HA）”;上述“②”的含義和反應(yīng)現(xiàn)象是“反應(yīng)孔中加入血凝性病毒（抗原）、相應(yīng)血清（抗體）、家禽紅細胞，孔底將會出現(xiàn)凝集抑制圖像，讀作‘凝集抑制，記作‘-，此反應(yīng)稱為凝集抑制反應(yīng)（HI）”。

3.推進判斷：將被檢血清作凝集抑制試驗，可以據(jù)反應(yīng)結(jié)果圖像確定其中是否含有相應(yīng)的抗體（孔底圖像為“凝集”時，被檢血清不含抗體;孔底圖像為“凝集抑制”時，被檢血清含有相應(yīng)抗體）。

4.拓展認識：在上述HI試驗中，如果對被檢血清不作稀釋，則試驗只可獲得一個定性的結(jié)果（確定血清中有或無相應(yīng)抗體）;如果對被檢血清作一系列的倍比稀釋，對每一個稀釋度的血清作HI反應(yīng)，則試驗就可依據(jù)最終出現(xiàn)完全抑制反應(yīng)的血清稀釋度的高低情況，獲得一個定量的結(jié)果（確定血清中相應(yīng)抗體有多少個log2）。

經(jīng)過上述方法對試驗原理作講解，絕大部分學(xué)生可以非常清楚的了解具血凝性病毒病免疫監(jiān)測技術(shù)的實驗依據(jù)、基本過程及反應(yīng)結(jié)果判定、記錄的基本方法等，明顯提高了學(xué)生學(xué)習(xí)本技術(shù)的主動性和學(xué)習(xí)效率。

鑒于實驗課程不允許花費過多的時間講授，筆者對上述講授內(nèi)容制作了簡明的PPT，使講授可控制在5分鐘之內(nèi)完成。如將本內(nèi)容前置于禽病學(xué)理論課中相關(guān)疫?。ㄈ缧鲁且撸┑脑\斷內(nèi)容中，加以扼要陳述，實驗課中再復(fù)習(xí)一下，效果會更好。

四、關(guān)于實驗用材

教師在實驗示范開始時，扼要、有序地介紹關(guān)鍵用材，有助于幫助學(xué)生對較復(fù)雜的實驗程序強化印象。在本實驗中，以新城疫免疫監(jiān)測為例，介紹試驗用材時，一方面，要讓學(xué)生注意新城疫免疫監(jiān)測所需的具體用材有哪些;另一方面，要讓學(xué)生注意不同的疫病，需采用哪些不同的用材。在介紹抗原時，要強調(diào)抗原必須為具有4個凝集單位的抗原。抗原凝集單位過高過低都會明顯影響抗體的檢測結(jié)果。對于準確配制4個凝集單位的抗原的術(shù)式，應(yīng)強調(diào)的關(guān)鍵包括：精確地實施HA試驗操作;準確地判讀HA試驗結(jié)果;依據(jù)HA試驗結(jié)果，準確計算和量取抗原原液及稀釋液將抗原原液稀釋為4個凝集單位的抗原液;正確地對初配的4個凝集單位的抗原液作滴定檢測和必要的矯正。對于紅細胞懸浮液的配制，操作程序不算復(fù)雜，一般無大問題，要強調(diào)的是，離心洗滌紅細胞的時間、速度標準化，吸取紅細胞沉淀物溶積要準確，水禽的免疫監(jiān)測試驗（即對白鴨、番鴨、鵝的血清檢測）應(yīng)采用同種的成年動物的紅細胞（或為減少制備紅細胞種類，檢測水禽血清時一般可通用成年番鴨的紅細胞）配制1%的紅細胞懸浮液。還要指出被檢血清的采集時機、方法和比例。

五、關(guān)于HI試驗操作

這是本實驗課的實操重點。教師應(yīng)當做一個精確到位的示范，并設(shè)法讓學(xué)生高度集中注意力觀察示范。HI實操環(huán)節(jié)常出現(xiàn)的問題：一是學(xué)生總感覺此操作較復(fù)雜，二是學(xué)生總會出現(xiàn)加樣出錯情況。據(jù)此，教師示范前先將HI試驗程序歸納為七步驟：（1）分裝稀釋液;（2）加入被檢血清;（3）稀釋血清;（4）加入4單位抗原;（5）加入紅細胞;（6）靜置感作;（7）判斷結(jié)果。示范過程，對每一個步驟邊示范邊強調(diào)1—2個關(guān)鍵點（學(xué)生易出錯點）。如分裝稀釋液注意最后一孔與前面各孔容量不同;被檢血清只加入第一孔;稀釋血清要統(tǒng)一吹打次數(shù)和移液準確性，最后二孔留作對照孔;最后一孔不加抗原，等等;示范結(jié)束時，讓學(xué)生共同回顧一次“七步驟”，旋即開始實操。這樣，基本上能保證95%以上的學(xué)生正確完成操作。HI試驗結(jié)果的判斷，也是完成本實驗的重中之重。如果不注意指導(dǎo)方法，也會使較大比例的學(xué)生出現(xiàn)誤判錯判的情況。依據(jù)多年的教學(xué)經(jīng)驗，筆者總結(jié)了結(jié)果判斷的示教要點如下：（1）首先要學(xué)生掌握好反應(yīng)結(jié)果判斷的基本時間，即以抗原對照孔和PBS對照孔反應(yīng)的情況做標準，當PBS對照孔的紅細胞完全沉降到孔中央，且反應(yīng)孔中的液體清亮?xí)r，為最佳反應(yīng)時間，即為判定反應(yīng)的終點時間。（2）以PBS對照孔的紅細胞的流淌程度為依據(jù)，凡是與PBS對照孔的紅細胞流淌情況一致的抗體檢測孔均判定為完全抑制孔。（3）要求學(xué)生逐一記錄抗體檢測孔的反應(yīng)圖像。（4）根據(jù)抗體檢測孔反應(yīng)系列圖像，找出完全抑制的最高血清稀釋度孔，以該孔血清稀釋度作為該血清的HI效價，寫出HI效價。（5）教師逐個檢查學(xué)生的試驗結(jié)果，特別是讓學(xué)生指出HI反應(yīng)的終點孔，并讀出HI效價。

六、關(guān)于實驗誤差規(guī)避

應(yīng)用HI試驗進行具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測，導(dǎo)致誤差的因素較多，在示教、示范過程和學(xué)生操作過程中，教師要做到心中有數(shù)，重點強調(diào)規(guī)避。除上述提及的一些操作要點外，尚需特別注意的環(huán)節(jié)有：正確使用移液器，滴管與移液器緊密接合，每次移液量盡可能準確;作抗體的稀釋吹打過程，力度要平穩(wěn)，每孔樣品吹打稀釋次數(shù)一致;4單位凝集抗原配制，必須進行滴定試驗，完全凝集孔要出現(xiàn)在第二孔，等等。

七、關(guān)于指導(dǎo)雞群接種

當學(xué)生正確掌握了HI試驗方法，并取得檢測結(jié)果后，教學(xué)的重點要轉(zhuǎn)入到如何依據(jù)HI試驗結(jié)果指導(dǎo)被檢禽群免疫工作上。（1）要正確引導(dǎo)學(xué)生討論雞群抗體臨界滴度的概念，確定科學(xué)的臨界滴度;（2）讓學(xué)生理解雞群抗體合格率的計算公式和計算方法;（3）讓學(xué)生理解和掌握不同日齡雞群免疫合格的標準;

（4）指導(dǎo)學(xué)生以免疫檢測的結(jié)果和免疫合格標準為主要依據(jù)，同時結(jié)合雞群其他情況，如相關(guān)免疫的時間間隔、雞群健康狀況、疫病流行動態(tài)等，對雞群的進一步免疫接種提出合理的意見。

八、時間與程序安排

本實驗課內(nèi)容較多，時間較緊，要比較合理地安排課程內(nèi)容，穿插安排示教、示范、學(xué)生操作，討論等程序。本實驗課一般可安排2—3個課時。安排2學(xué)時時，4單位凝集抗原和紅細胞懸浮液均應(yīng)預(yù)先配備。教學(xué)過程可安排為：（1）教師簡單解題和指出目的內(nèi)容，確切說明原理;（2）扼要示范，點明用材，強調(diào)實驗程序和操作注意事項;（3）在教師的巡視下，學(xué)生操作至抗原抗體感作步驟;（4）利用抗原抗體感作時間，教師具體指導(dǎo)結(jié)果判定的記錄方法和禽群免疫指導(dǎo)的方法;（5）學(xué)生判定記錄結(jié)果;教師對學(xué)生實驗結(jié)果及判斷記錄逐一作確認;（6）師生共同依據(jù)免疫監(jiān)測結(jié)果討論指導(dǎo)禽群免疫接種的方法;（7）實驗課小結(jié)，指出實驗存在問題，布置實驗報告作業(yè)，強調(diào)實驗報告寫作的注意事項。為了簡明扼要，節(jié)約時間，對于實驗原理、4單位凝集抗原制備、紅細胞懸浮液配備、實驗結(jié)果的判定方法、禽群免疫合格率計算與免疫指導(dǎo)方法討論等環(huán)節(jié)，都建議制備和使用合適的PPT輔助示教。

九、關(guān)于作業(yè)批改要點

就課堂教學(xué)而言，做好作業(yè)批改，是糾正學(xué)生技術(shù)錯誤，提高實驗課效率的最后一個重要環(huán)節(jié)。多年來，我們發(fā)現(xiàn)學(xué)生發(fā)生率較高的錯誤點，包括：不如實陳述實驗用材，誤將HA程序誤為HI程序，HI反應(yīng)終點“圖”、“數(shù)”不一致（HI效價概念不清），雞群抗體臨界滴度概念錯誤，雞群抗體合格率公式套用數(shù)據(jù)錯誤，實驗報告格式欠規(guī)范，等等，這些問題都被我們列為作業(yè)批改的主要關(guān)注點。

十、小結(jié)

“雞新城疫免疫監(jiān)測”實驗課非常重要。適當修改課題和課程目的，內(nèi)容上兼顧到幾種相關(guān)傳染病的免疫監(jiān)測;注意實驗用材、實驗操作關(guān)鍵點和結(jié)果判斷方法要點的教學(xué)指導(dǎo)、示范;注意講清部分容易出現(xiàn)歧義的概念，規(guī)避歧義;避免易造成實驗誤差的各種因素;加強應(yīng)用實驗結(jié)果指導(dǎo)臨床免疫方法的討論、分析;精心穿插、安排教學(xué)過程中的各部分內(nèi)容，提高教學(xué)效率。如此，將可進一步改善本實驗課的教學(xué)質(zhì)量，使之在雞新城疫、鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產(chǎn)蛋下降綜合征感染等傳染病的免疫防控中發(fā)揮更多作用。不僅如此，由于本實驗涉及眾多獸醫(yī)傳統(tǒng)實驗的基本技能，實際上是一個獸醫(yī)實驗綜合技能訓(xùn)練的實驗課程，因此，不斷探索改進本課程的教學(xué)方法，對于強化獸醫(yī)專業(yè)高年級學(xué)生獸醫(yī)實驗技能的綜合應(yīng)用能力，以及提高其學(xué)習(xí)應(yīng)用現(xiàn)代獸醫(yī)高新實驗技術(shù)的能力，均有裨益，值得同行給以更多的注意和重視。

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Study on the Application of HA/HI Test in Poultry Immunosurveillance

ZHANG Ji-pei，CHEN Ji-dang，CHEN Jian-hong，SI Xing-kui

（Department of Animal Medicine，College of Life Sciences and Engineering，F(xiàn)oshan Institute of Science and Technology，F(xiàn)oshan，Guangdong 528231，China）

Abstract：This paper deals with several aspects of experimental teaching in the application of hemagglutination （HA） and hemagglutination inhibition （HI） test （micro method） to the immune monitoring of epidemic diseases such as newcastle disease in poultry，including course title，teaching purpose，teaching content，and so on.Experiment material，operation key，result judgment，error evading，instruction inoculation，time arrangement，etc.，this paper discusses the discussion and experience of teaching reform in the past years，in order to improve the teaching effect and improve teaching efficiency of this experiment course.Close to the reality of production，strengthen the role of production guidance and other purposes.

Key words：newcastle disease;immune surveillance;experimental class;teaching reform