液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

李明瑛，姚恒波，柴青峰，席秀娥，王 霞，牛文一

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科四病區(qū)，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核病研究所，河南 衛(wèi)輝 453100)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染病，也是單一致病菌感染導(dǎo)致病死率最高的疾病，我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，發(fā)病率僅次于印度及印度尼西亞[1]。結(jié)核病可以累及多個(gè)器官，包括肺、骨、腎等，其中肺結(jié)核最常見(jiàn)且最具有傳染性。早期診斷對(duì)肺結(jié)核的防控和治療至關(guān)重要[2]。目前，細(xì)菌學(xué)檢測(cè)仍是肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，常用的檢查方法為直接痰涂片鏡檢法(簡(jiǎn)稱“直接涂片法”)和羅氏培養(yǎng)法。直接涂片法操作簡(jiǎn)單，成本低，但陽(yáng)性率低；羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性率高，但培養(yǎng)周期需要4～8周[3]；這2種方法均不能完全滿足臨床診治的需要。液基細(xì)胞學(xué)涂片法抗酸桿菌檢測(cè)技術(shù)(簡(jiǎn)稱“液基細(xì)胞學(xué)涂片法”)是通過(guò)特殊的痰保存液液化痰液，采用離心方法收集細(xì)菌的過(guò)程，提高痰抗酸桿菌的檢出率，并結(jié)合液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)，達(dá)到痰涂片的標(biāo)準(zhǔn)化。本研究應(yīng)用直接涂片法、羅氏培養(yǎng)法和液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)同一痰液標(biāo)本中的抗酸桿菌，探討液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科2017年6～8月收治的251例肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，其中男141例，女110例，年齡18～72(47.0±18.4)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。入選病例均符肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.2主要試劑與儀器抗酸菌染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，標(biāo)本保存液(宜興市潤(rùn)迪醫(yī)療器械有限公司)；抗酸桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)管(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，KP-1型快速干片機(jī)(常州派斯杰公司)，調(diào)速多用振蕩器HY-4(常州國(guó)華電器有限公司)，薄層液基細(xì)胞制片機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)，數(shù)顯三用恒溫水箱(常州國(guó)宇儀器制造有限公司)。

1.3檢測(cè)方法留取患者夜間痰、晨痰、即時(shí)痰各1份，每份5.0～8.0 mL。對(duì)每份痰液標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行直接涂片法、液基細(xì)胞學(xué)涂片法和羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)。直接涂片法按照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃—痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]進(jìn)行操作；液基細(xì)胞學(xué)涂片法是將已采樣的痰液保存瓶瓶蓋擰緊靜置 5 min 后震蕩3 min進(jìn)行液化，70 ℃水浴恒溫箱中加熱15 min，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，提取10～20 μL濃縮樣本加入制片夾中并加入 1 mL 蒸餾水，1 min制片即可完成，最后烘干玻片，苯酚染色2 min，水洗，鹽酸乙醇分化至無(wú)紅色染料脫落水洗，亞甲基藍(lán)染色30 s，水洗，上鏡觀察。羅氏培養(yǎng)法按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行操作。

1.4液基細(xì)胞學(xué)涂片法安全性試驗(yàn)取直接涂片法及液基細(xì)胞學(xué)涂片法均為3+或4+的痰液標(biāo)本12份，每份約2 mL，其中6份加入1倍的樣本保存液處理5～15 min后，3份加熱，3份不加熱，均進(jìn)行羅氏培養(yǎng)，另外6份加入2倍的樣本保存液，處理時(shí)間及方法同上，觀察抗酸桿菌的生長(zhǎng)情況。

1.5質(zhì)量控制直接涂片法質(zhì)量控制按照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃—痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》[5]進(jìn)行，液基細(xì)胞學(xué)涂片法及羅氏培養(yǎng)法均按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13種方法對(duì)不同時(shí)間痰液中抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率比較結(jié)果見(jiàn)表1。直接涂片法、液基細(xì)胞學(xué)涂片法和羅氏培養(yǎng)法對(duì)夜間痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率分別為12.35%(31/251)、22.31%(56/251)、23.90%(60/251)，對(duì)晨痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率分別為21.51%(54/251)、30.28%(76/251)、32.27%(81/251)，對(duì)即時(shí)痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率分別為7.97%(20/251)、13.94%(35/251)、15.94%(40/251)。直接涂片法、液基細(xì)胞學(xué)涂片法和羅氏培養(yǎng)法對(duì)晨痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率高于夜間痰和即時(shí)痰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.492、18.323、4.111、19.443、4.349、18.305，P<0.05)。液基細(xì)胞學(xué)涂片法、羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)夜間痰、晨痰、即時(shí)痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率高于直接涂片法(χ2=8.690、5.024、4.594、11.288、7.386、7.571，P<0.05)；液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)夜間痰、晨痰、即時(shí)痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率與羅氏培養(yǎng)法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.179、0.232、0.392，P>0.05)。

表13種方法檢測(cè)不同時(shí)間痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率比較

Tab.1Comparisonofpositivedetectionratesofacid-fastbacillusatdifferenttimedetectedbythreemethods

n直接涂片法陽(yáng)性/例(%)陰性/例(%)液基細(xì)胞學(xué)涂片法陽(yáng)性/例(%)陰性/例(%)羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性/例(%)陰性/例(%)χ2P夜間痰25131(12.35)a220(87.65)56(22.31)ab195(77.69)60(23.90)ab191(76.10)12.527<0.05晨痰25154(21.51)197(78.49)76(30.28)b175(69.72)81(32.27)b170(67.73)8.151<0.05即時(shí)痰25120(7.97)a231(92.03)35(13.94)ab216(86.06)40(15.94)ab211(84.06)7.829<0.05χ221.83719.578-56.475P<0.05<0.05<0.05

注：與晨痰比較aP<0.05；與直接涂片法比較bP<0.05。

2.23種方法對(duì)不同性質(zhì)痰液中抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率比較結(jié)果見(jiàn)表2。在753份痰液標(biāo)本中，膿性痰301份，血痰48份，黏液痰334份，唾液痰70份。直接涂片法對(duì)膿性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸桿菌陽(yáng)性檢出率分別為36.21%(109/301)、41.67%(20/48)、8.08%(27/334)、2.86%(2/70)；液基細(xì)胞學(xué)涂片法對(duì)膿性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率分別為48.84%(147/301)、64.58%(31/48)、11.98%(40/334)、14.29%(10/70)；羅氏培養(yǎng)法對(duì)膿性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率分別為50.17%(151/301)、62.50%(30/48)、15.27%(51/334)、15.71%(11/70)。直接涂片法、液基細(xì)胞學(xué)涂片法和羅氏培養(yǎng)法對(duì)血痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率高于膿性痰、黏液痰、唾液痰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.102、43.867、28.275、4.107、76.758、31.772、4.214、56.033、27.490，P<0.05)。液基細(xì)胞學(xué)涂片法、羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)膿性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率高于直接涂片法(χ2=9.814、11.943、5.061、4.174、4.103、8.361、26.054、23.941，P<0.05)；液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)膿性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率與羅氏培養(yǎng)法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.106、0.045、1.539、0.056，P>0.05)。

表23種方法檢測(cè)不同性質(zhì)痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率比較

Tab.2Comparisonofthepositivedetectionratesofacid-fastbacilluswithdifferentpropertiesdetectedbythreemethods

n直接涂片法陽(yáng)性/例(%)陰性/例(%)液基細(xì)胞學(xué)涂片法陽(yáng)性/例(%)陰性/例(%)羅氏培養(yǎng)法陽(yáng)性/例(%)陰性/例(%)χ2P膿性痰301109(36.21)a192(63.79)147(48.84)ab154(51.16)151(50.17)ab150(49.83)14.421<0.05血痰4820(41.67)28(58.33)31(64.58)17(35.42)30(62.50)18(37.50)6.265<0.05黏液痰33427(8.08)a307(91.92)40(11.98)ab294(88.02)51(15.27)ab283(84.73)8.319<0.05唾液痰702(2.86)a68(97.14)10(14.29)ab60(85.71)11(15.71)ab59(84.29)7.129<0.05χ2101.883137.345117.119P<0.05<0.05<0.05

注：與血痰比較aP<0.05；與直接涂片法比較bP<0.05。

2.33種方法檢測(cè)痰抗酸桿菌的靈敏度、特異度比較以羅氏培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，直接涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌的靈敏度和特異度分別為40.33%、94.41%，液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌的靈敏度和特異度分別為70.72%、93.18%；液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌的靈敏度高于直接涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.507，P<0.05)；液基細(xì)胞學(xué)涂片法與直接涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌的特異度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.237，P>0.05)。

2.4液基細(xì)胞學(xué)涂片法安全性試驗(yàn)結(jié)果在標(biāo)本中加入1倍或2倍痰保存液后，分別放置5、10、15 min，無(wú)論是否加熱，接種于羅氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周，均未見(jiàn)抗酸桿菌生長(zhǎng)。

3 討論

我國(guó)每年有約80萬(wàn)的新發(fā)結(jié)核病患者，活動(dòng)性肺結(jié)核患者高達(dá)500萬(wàn)人[7]。目前，結(jié)核病防控面臨的主要問(wèn)題是缺乏及時(shí)有效可靠的診斷，導(dǎo)致結(jié)核病不能及時(shí)治療。一些主流的結(jié)核病診斷方法均存在一定的局限性，結(jié)核菌素皮膚實(shí)驗(yàn)由于結(jié)核桿菌的高感染率和卡介苗的使用導(dǎo)致其臨床應(yīng)用價(jià)值不高，影像學(xué)資料因臨床醫(yī)生主觀意識(shí)較強(qiáng)常無(wú)法達(dá)到一致，內(nèi)鏡結(jié)合病理學(xué)檢查具有侵入性，且不易操作，因此，痰涂片抗酸桿菌鏡檢仍是我國(guó)開(kāi)展結(jié)核病控制項(xiàng)目時(shí)最符合成本效益原則的細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)技術(shù)[2]，它具有簡(jiǎn)單、快速、易行、可靠的特點(diǎn)，但敏感性不高，當(dāng)每毫升痰液中抗酸桿菌濃度達(dá)到 5 000～10 000 條時(shí)，結(jié)果才呈陽(yáng)性。液基細(xì)胞學(xué)涂片法將標(biāo)本全部保存于液基保存液中，最大限度地提取痰液進(jìn)行制片，細(xì)菌采集量大大增加，并通過(guò)離心、甩片等過(guò)程，將細(xì)胞和細(xì)菌單層均勻地分布在玻片上，無(wú)重疊擠壓或物理?yè)p傷變形，形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)保持良好，涂片中也除去了血液和黏液的成分，背景清晰干凈，細(xì)胞形態(tài)保持良好，易于觀察診斷[8]；液基細(xì)胞學(xué)涂片法的顯著特點(diǎn)是對(duì)痰標(biāo)本的利用率高，符合不丟棄任何所取材料的原則[9]，對(duì)保存在液基瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞可以制作多張涂片，對(duì)同一標(biāo)本也可以進(jìn)行多項(xiàng)檢查，如免疫細(xì)胞化學(xué)檢查及基因檢測(cè)等，同時(shí)，液基細(xì)胞染色技術(shù)使痰涂片達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，降低了因在涂片和染色過(guò)程中不按程序規(guī)范操作導(dǎo)致的結(jié)果差異[10]。

研究顯示，直接涂片法檢測(cè)晨痰，其抗酸桿菌陽(yáng)性率約20%[11-12]，而羅氏培養(yǎng)法對(duì)臨床結(jié)核病患者晨痰中抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率約為30%[13-14]，這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率明顯高于直接涂片法；液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率略低于羅氏培養(yǎng)法，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以羅氏培養(yǎng)法作為檢測(cè)痰抗酸桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)，液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌的靈敏度和特異度分別為70.72%、93.18%，直接涂片法的靈敏度和特異度分別為40.33%、94.41%，液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌的靈敏度高于直接涂片法，特異度相仿。

影響痰抗酸桿菌檢測(cè)的主要因素有標(biāo)本性質(zhì)、操作人員操作不規(guī)范等，而液基細(xì)胞學(xué)涂片法可以有效減少操作人員的操作誤差，實(shí)現(xiàn)涂片的標(biāo)準(zhǔn)化。在對(duì)痰標(biāo)本性質(zhì)的影響中，本研究主要討論了留痰時(shí)間和痰液性質(zhì)，結(jié)果顯示，3種檢測(cè)方法對(duì)晨痰中抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率最高。故在臨床工作中，建議送檢晨痰，有利于提高痰抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率。且本研究結(jié)果顯示，3種檢測(cè)方法對(duì)血痰中抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率最高，這可能與結(jié)核病情活動(dòng)性較強(qiáng)，且血痰多來(lái)自病灶的空洞內(nèi)有關(guān)。

本研究還進(jìn)行了液基細(xì)胞學(xué)涂片法安全性試驗(yàn)，12份痰液標(biāo)本經(jīng)不同比例的標(biāo)本保存液處理 5～15 min后，無(wú)論是否加熱，羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果顯示均未見(jiàn)抗酸桿菌生長(zhǎng)，提示液基細(xì)胞學(xué)涂片法的生物安全性高，相比直接涂片法對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員的安全更有保障。

綜上所述，液基細(xì)胞學(xué)涂片法檢測(cè)痰抗酸桿菌操作簡(jiǎn)便易行，成本低廉，人為因素影響少，易標(biāo)準(zhǔn)化，陽(yáng)性檢出率高，有很好的生物安全性，可以彌補(bǔ)直接痰涂片鏡檢法的不足，提高了對(duì)肺結(jié)核臨床診斷的指導(dǎo)意義，為患者盡早進(jìn)行正規(guī)抗結(jié)核治療贏得了寶貴時(shí)間。