溫度誘導對鼠李糖乳桿菌cspc mRNA基因表達和生長速率的影響

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(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑部,內(nèi)蒙古呼和浩特 010059)

鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),最適生長溫度37 ℃,兼性厭氧[1-2]。LGG由兩位美國科學家Sherwood Gorbach和Barry Goldin在上世紀80年代發(fā)現(xiàn),該菌分離自健康人體腸道[3],大量研究證明LGG能夠定植于腸道,通過調(diào)節(jié)腸道菌群,起到抵御病原微生物的侵襲等作用,具有預防和治療腹瀉、預防呼吸道感染、預防齲齒、抗過敏的作用,提高機體免疫力等功效[4],LGG在酸奶、飲料、奶粉、奶酪、保健品等均有應用。

通常,LGG可通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝獲得,進一步通過冷凍干燥的方法獲得菌粉,菌粉是微生物的最佳保存方式,然而冷凍干燥會不可避免的造成乳桿菌細胞膜的損傷,具體的損傷包括:機械損傷、溶質(zhì)損傷、細胞膜滲透性損傷[5]、蛋白質(zhì)變性失活、pH平衡的破壞和細胞膜脂肪酸的變化[6-7]。然而,微生物也會通過改變膜的流動性和改變蛋白質(zhì)的翻譯來適應低溫環(huán)境。冷休克蛋白(cold shock proteins,Csps)是微生物為適應低溫環(huán)境產(chǎn)生的應激蛋白,大腸桿菌在低溫誘導過程中會產(chǎn)生大量GspA蛋白,可占到細胞總蛋白合成的13%,隨后又發(fā)現(xiàn)了8中同源性蛋白:CspB、CspC、CspD、CspE、CspF、CspG、CspH、CspI蛋白[8]。枯草芽孢桿菌在低溫環(huán)境下有13個Csps蛋白被誘導產(chǎn)生。在低溫條件下Csps蛋白可以作為RNA的分子伴侶,與mRNA結合,穩(wěn)定RNA,促進菌體在低溫條件下轉錄并翻譯[9],其中CspA、CspB、CspG、CspI蛋白在低溫誘導下產(chǎn)生,CspC、CspE蛋白在正常培養(yǎng)條件下產(chǎn)生[10,11]。然而,與CspA蛋白不同的是CspC蛋白的表達量隨溫度的升高而降低,使用基因敲除的方法去除大腸桿菌的cspc基因后,發(fā)現(xiàn)菌體的生長明顯加快[12]。說明CspC有抑制菌體生長的作用,因此在生長過程中抑制CspC蛋白的表達可能會有利于提高菌體的生長速率。然而對于LGGcspcmRNA基因的研究還未見報道。

本文通過對LGG進行溫度誘導處理,通過熒光實時定量PCR(RT-PCR)的方法檢測cspc的表達,并且對誘導后的菌體進行生長速率的測定,以考察溫度誘導對cspcmRNA基因表達的影響,以及對菌體生長速率的影響,揭示cspcmRNA基因與生長速率的關系,為提高LGG的產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)GD20150520 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院生物制藥實驗室;酪蛋白胨、酵母粉、牛肉粉 北京奧博星生物技術有限責任公司;葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸三銨、吐溫-80、MgSO4、K2HPO4、瓊脂粉 國藥集團化學試劑有限公司;cspc基因引物序列(F:5′-TGATAA GGGTTACGGCTTCA′,R:5′-GGCCACGATCAGATTG TTCTAC-3′),產(chǎn)物長度140 bp、16S rDNA引物序列(F:5′-TAGCGTACCATCTGATCCAGTA′,R:5′-GAAGTCGTCGCGTTGACA-3′),產(chǎn)物長度187 bp 美國Invitrogen;RNA提取試劑盒(RNAiso PlusD9108A)、cDNA反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent KitDRR037A)、RT-PCR試劑盒 日本Takara。

ViiA7熒光定量PCR儀 美國ABI;Mini-sub cell GT電泳儀 美國Bio-Rad;Mutiskan FC酶標儀 美國Thermo。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵 培養(yǎng)菌種采取四級發(fā)酵培養(yǎng)方法,一、二、三級為種子擴大培養(yǎng)基,四級為最終發(fā)酵培養(yǎng)基,一級培養(yǎng)基接入0.3 g的凍干菌種,混勻,放置恒溫厭氧培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。二級培養(yǎng)基由培養(yǎng)好的一級發(fā)酵液按4%的接種量接入,培養(yǎng)12 h。以此類推,傳代到四級最終發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 活菌數(shù)的測定 采用平板混菌計數(shù)法[13]。

1.2.3 生長曲線測定 四級發(fā)酵液按不同的時間點(0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20 h)取樣,測定發(fā)酵液活菌數(shù),制作生長曲線。

1.2.4cspcmRNA基因表達量法檢測 mRNA的表達量根據(jù)GenBank上報道的鼠李糖乳桿菌的cspc基因序列,利用Prime5.0軟件設計RT-PCR法檢測cspc基因的引物。提取鼠李糖乳桿菌總RNA,按試劑盒說明書方法操作,用酶標儀檢測RNA純度,OD260/OD280在1.8～2.0為符合要求的RNA。反轉錄cDNA,按照試劑盒說明操作,RNA上樣量為2.0 μL(約500 ng),反應條件:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s結束反應,得到cDNA。

熒光定量PCR,按照試劑盒說明書方法操作,以cDNA為模板,加入cspc基因的引物,通過實時熒光實時定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)方法擴增cspc基因。反應條件:預變性95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 5 s,退火60 ℃ 34 s讀板,共40個循環(huán);從65 ℃到95 ℃制作融解曲線。以16s rDNA為內(nèi)參基因,以確定cspcmRNA基因的相對表達量。產(chǎn)物做電泳檢測分析,膠回收,產(chǎn)物送測序Invitrogen公司,NCBI blast比對分析。

RT-PCR所獲得的數(shù)據(jù),利用2-ΔCt(ΔCt=cspc基因Ct值-16S rRNA Ct值)公式進行cspcmRNA基因在LGG中相對表達量計算。

1.2.5 溫度誘導cspcmRNA基因表達試驗 將鼠李糖乳桿菌四級發(fā)酵液分別置于37、39、41、43、45 ℃的恒溫水浴中分別處理10、15、20、25、30 min,即按照5組(溫度)×5組(時間)設計,共25組試驗,每組試驗設3個重復,37 ℃為對照組。RT-PCR法檢測cspcmRNA基因的表達量[14]。

1.2.6 溫度誘導后菌體的生長速率測定 在三級發(fā)酵接種到四級培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h時,即菌體進入對數(shù)生長期后,按1.2.5確定的最佳誘導溫度和時間進行溫度誘導,之后繼續(xù)培養(yǎng)4 h再次進行溫度誘導,之后再繼續(xù)培養(yǎng)12 h結束發(fā)酵。RT-PCR法檢測菌體的cspcmRNA基因表達量,活菌數(shù)法測定菌體生長曲線,并計算生長速率,生長速率=(lg活菌數(shù)t1-lg活菌數(shù)t0)/(t1-t0)(t1、t0表示發(fā)酵時間點),以未進行溫度誘導作為對照[14]。

1.2.7 凍干驗證試驗 為了考察溫度誘導對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響,在終止發(fā)酵后對菌體進行冷凍干燥[14]。鼠李糖乳桿菌四級發(fā)酵誘導組、對照組,發(fā)酵液經(jīng)10000 r/min離心20 min,棄去上清液,保留菌體,加入凍干保護劑(凍干保護劑:25%脫脂奶粉、10%乳糖、10%抗壞血酸)混勻,-40 ℃預冷30 min,真空干燥36 h得到凍干菌粉。菌粉懸溶于100 mL PBS中混勻,活菌數(shù)法測定混懸液的活菌數(shù),計算凍干菌粉總活菌數(shù)(凍干菌粉總活菌數(shù)=混懸液活菌數(shù)濃度×100 mL)。根據(jù)發(fā)酵液總活菌數(shù)(發(fā)酵液總活菌數(shù)=發(fā)酵液活菌數(shù)濃度×發(fā)酵液體積),計算凍干存活率。凍干存活率(%)=凍干菌粉總活菌數(shù)/發(fā)酵液總活菌數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗設3個重復,試驗數(shù)據(jù)均采用平均值和標準誤差表示,應用Tukey test檢驗進行分析,p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌生長曲線

鼠李糖乳桿菌生長曲線如圖1。

圖1 鼠李糖乳桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus rhamnosus GG

如圖1所示,鼠李糖乳桿菌生長良好,0～3 h是菌體的適應期,3～12 h是菌體的對數(shù)生長期,12～16 h是菌體的穩(wěn)定生長期,16 h之后菌體進入衰退期。

2.2 鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆及電泳驗證

鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆電泳結果見圖2。

圖2 cspc基因RT-PCR電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of cspc RT-PCR product注:M:Marker;S1、S2:cspc基因樣品1、2。

如圖2所示鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆片段,大小為140 bp,產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、測序、比對,確認為cspc目標基因。

2.3 溫度誘導對cspc mRNA基因表達的影響

CspC蛋白是CspA蛋白家族中的一個成員,與CspA蛋白不同的是,CspC蛋白不需要低溫誘導表達,在37 ℃即可表達,研究顯示[15-16],CspC蛋白與染色體凝集和細胞分裂有關,并且有抗轉錄終止的作用。Shenhar等[17]研究表明,CspC蛋白可以促進細菌脅迫應答因子(RpoS)的表達,RpoS是微生物在環(huán)境壓力產(chǎn)生的適應性因子,因此可以說CspC蛋白是微生物對抗環(huán)境壓力的重要因子。然而,其具體的生物學功能還不是十分明確。與CspA蛋白不同的是,CspC蛋白的表達量隨溫度的升高而降低,然而對于鼠李糖乳桿菌cspcmRNA基因的研究還未見報道。本研究通過升高溫度抑制LGGcspcmRNA基因的表達,如圖3所示,在對照37 ℃時,不同的作用時間對其表達量沒有影響,而在溫度高于37 ℃時,菌體cspcmRNA基因的表達量明顯下調(diào),說明溫度升高可以抑制菌體產(chǎn)生cspcmRNA基因,且在43 ℃誘導30 min,菌體cspcmRNA基因的表達量最低,且差異極顯著(p<0.01)。

圖3 溫度誘導后csps mRNA基因的相對表達量Fig.3 Relative mRNA expression of csps after temperature treatment注：*代表差異性顯著(p<0.05);**代表差異性極顯著(p<0.01)，圖6同。

2.4 溫度誘導后菌體的生長速率測定結果

本研究中,通過升高溫度抑制菌體cspcmRNA基因的表達,結果如圖4所示,在接種后生長第4和8 h,菌體經(jīng)43 ℃、30 min誘導,菌體cspcmRNA基因的表達明顯降低,而隨著溫度降至37 ℃,cspcmRNA基因的表達又恢復到原來水平。如圖5所示,經(jīng)過誘導后的鼠李糖乳桿菌生長明顯加快,且活菌數(shù)明顯升高。如圖6所示,經(jīng)過兩次誘導后,與對照組相比,誘導組4～6 h以及8～10 h的生長速率明顯增高,差異顯著(p<0.05),而6～8 h和10～12 h兩組的生長速率差異不顯著。

圖4 溫度誘導條件下菌體cspc mRNA基因的相對表達量Fig.4 Relative mRNA expression of cspc after temperature induction

圖5 溫度誘導條件下菌體的生長曲線Fig.5 Growth curves of cells after temperature induction

圖6 溫度誘導條件下菌體4～12 h的生長速率Fig.6 Growth rate in 4～12 h after temperature induction

2.5 鼠李糖乳桿菌凍干驗證試驗

如圖7所示,誘導組與對照組相比,其凍干存活率無明顯差異,說明溫度誘導只影響菌體的生長速率,并不影響菌體的凍干存活率。

圖7 菌體凍干存活率驗證結果Fig.7 Testify result of freeze-drying survival rate of bacteria

3 結論

本研究對鼠李糖乳桿菌進行不同溫度和時間的誘導處理,考察cspcmRNA基因的表達量,并考察在溫度誘導后菌體的生長速率,結果顯示,經(jīng)43 ℃、30 min誘導,菌體cspcmRNA基因的表達明顯降低,且誘導后菌體的生長速率明顯升高,溫度誘導相比基因敲除具有安全的優(yōu)點,可應用于鼠李糖乳桿菌規(guī)模化發(fā)酵過程中,以提高菌體的產(chǎn)量。此外,研究顯示,通過兩次溫度誘導,鼠李糖乳桿菌的凍干存活率并未下降,也證明了該方法的可行性。