角蛋白酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展

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(發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北工業(yè)大學(xué),湖北武漢 430068)

角蛋白是一種硬質(zhì)不溶性蛋白,由于其分子間富含二硫鍵以及疏水氨基酸,使其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,難以被降解利用。目前工業(yè)降解角蛋白的手段主要有高溫高壓水解法、酸堿水解法和傳統(tǒng)酶解法,但這些方法都存在著高耗能、高污染甚至破壞氨基酸結(jié)構(gòu)等問題[1]。而角蛋白酶能夠?qū)Ｒ恍缘慕到饨堑鞍?不僅綠色環(huán)保,且不會(huì)破壞氨基酸天然結(jié)構(gòu),是一種理想的工業(yè)降解角蛋白廢棄物的方式,并且角蛋白酶作為一種多功能酶,在食品、藥品、清潔及皮毛加工等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。角蛋白酶的微生物來源廣泛,導(dǎo)致許多角蛋白酶的性質(zhì)各異,選擇合適的角蛋白酶用于工業(yè)生產(chǎn)意義重大。本文綜述了角蛋白酶來源、分類及性質(zhì)、基因工程研究、作用機(jī)制及應(yīng)用等研究進(jìn)展,以期為今后的角蛋白酶生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 角蛋白酶的來源、分類及性質(zhì)

角蛋白酶是一種底物非常廣的蛋白酶,能夠降解多種可溶性及不可溶性蛋白質(zhì),如膠原蛋白、纖維蛋白、牛乳清蛋白、血紅蛋白、酪蛋白等,最特別的就是它能夠降解天然的角蛋白,使其變成可溶的氨基酸和多肽,并且作用條件溫和[2]，相比于其他傳統(tǒng)的蛋白酶有著明顯優(yōu)勢[3]。角蛋白酶的發(fā)現(xiàn),讓人們找到了一種理想的,將角蛋白廢棄物變廢為寶的新途徑。

1.1 角蛋白酶的來源

目前發(fā)現(xiàn)的角蛋白酶多來源于細(xì)菌,如Baclicus,Chryseobacterium,Stenotrophomonas,Caldicoprobacter,Vibrio和Pseudomonas等[4-9]。 其中芽孢桿菌屬占主導(dǎo)地位,同時(shí)研究也最為深入。而部分放線菌也能夠產(chǎn)角蛋白酶,主要為鏈霉菌屬[10],如Streptomycesgulbargensis,Streptomycesfradiae,Streptomycesalbidoflavus等。真菌中有著大量的產(chǎn)角蛋白酶群體,其典型代表就是人體表的腐生真菌,包括引起甲真菌病的Scopulariopsisbrevicaulis[11]和引起皮膚真菌感染的Trichophytonmentagrophytes,Candidaalbicans,Microsporumcanis[11-15]等。除此之外,Kaul等[16]從100只鳥的羽毛中分離出了14種產(chǎn)角蛋白酶的真菌,分別屬于10個(gè)不同的屬:Chrysoporium,Malbranchea,Chaetomium,Sepedonium,Microascus,Scopulariopsis,Curvularia,Fusarium,Aspergillus,Penicillium,該發(fā)現(xiàn)在很大程度上擴(kuò)大了角蛋白酶的研究范圍。

以上微生物可以在養(yǎng)殖場以及屠宰場附近的土壤中或者動(dòng)物的表皮、毛發(fā)上采集到,并使用粉狀角蛋白作為培養(yǎng)基中的唯一碳氮源,能夠篩選產(chǎn)角蛋白酶的微生物,并挑選水解圈與菌落直徑比值較大的菌落進(jìn)行發(fā)酵測試,獲得其中高產(chǎn)角蛋白酶的菌株。蔣彪等[17]通過這種篩選手段獲得了一株高產(chǎn)角蛋白酶的菌株Bacillussp。

1.2 角蛋白酶的分類

按照蛋白酶活性中心分類[18],角蛋白酶可分為三類,分別為:絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶。其中絲氨酸蛋白酶類的角蛋白酶數(shù)量最多,應(yīng)用也最廣,主要產(chǎn)自細(xì)菌,蛋白多序列比對發(fā)現(xiàn)這些微生物絲氨酸蛋白酶在多個(gè)區(qū)域高度保守,三聯(lián)催化體Asp、His、Ser分別存在這些保守區(qū)域中,對于角蛋白的水解起到重要作用。金屬蛋白酶類的角蛋白酶在細(xì)菌、放線菌和真菌中都有報(bào)道,其活性中心含有Zn2+等二價(jià)金屬,對于其催化功能具有重要作用。而一些角蛋白酶同時(shí)屬于絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶,同時(shí)擁有以上兩類酶的性質(zhì)。天冬氨酸蛋白酶類的角蛋白酶目前只在人體腐生真菌Candidaalbicans中有發(fā)現(xiàn),活性中心含天冬氨酸,這種蛋白酶是Candidaalbicans感染人體皮膚的作用因子[13-14]。

1.3 角蛋白酶的理化性質(zhì)

角蛋白酶是微生物經(jīng)環(huán)境誘導(dǎo)后分泌的胞外酶,通過降解天然的蛋白底物為自身生長提供碳氮源。由于這些微生物生長環(huán)境以及種屬不同,其分泌的角蛋白酶在各種性質(zhì)上也會(huì)有差異,如表1。

表1 角蛋白酶的理化性質(zhì)Table 1 The properties of keratinases

1.3.1 分子量 目前發(fā)現(xiàn)角蛋白酶的分子量從18～240 kDa都有發(fā)現(xiàn),但大多都在30～60 kDa左右,其中芽孢桿菌屬分泌的枯草桿菌蛋白酶之間具有高度的同源性,在許多性質(zhì)上都非常相似,所以同屬這個(gè)大家族的角蛋白酶的分子量也接近,均在30 kDa左右[19-21],而有些分子量高達(dá)幾百kDa的角蛋白酶可能是復(fù)合酶[22]。

1.3.2 最適pH和溫度 多數(shù)角蛋白酶最適pH基本都大于等于7,為中性或者堿性蛋白酶,而一些人體腐生真菌產(chǎn)的角蛋白酶在酸性條件下有最佳酶活[12-14],這可能與人體的皮膚環(huán)境為弱酸性有關(guān);大部分角蛋白酶最適溫度在40～60 ℃范圍內(nèi),而一些極端高溫條件下生長的微生物,其分泌角蛋白酶能表現(xiàn)出極佳的熱穩(wěn)定性(70 ℃以上)[7,23-24],有著相當(dāng)高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

1.3.3 底物特異性 角蛋白酶對于多種天然蛋白底物及人工蛋白底物有著不同的降解作用,大量可溶蛋白均能被角蛋白酶降解,如牛乳清蛋白、蛋清蛋白、酪蛋白、血紅蛋白以及經(jīng)過改造的氮角蛋白等,而在底物為不溶性蛋白時(shí),如:羽毛、羊毛、人發(fā)、角質(zhì)層、膠原蛋白,由于其特異性存在差異,多數(shù)細(xì)菌與放線菌來源的角蛋白酶對動(dòng)物毛發(fā)有著較強(qiáng)的降解作用,而一些人體腐生真菌主要降解底物為人角質(zhì)層和指甲,幾乎不能降解動(dòng)物毛發(fā),這可能是長時(shí)間的環(huán)境選擇進(jìn)化決定的[12-14]。

1.3.4 影響其性質(zhì)的一些化學(xué)環(huán)境 Ca2+、Mg2+對多數(shù)角蛋白酶有著很好的激活作用,Ni2+、Hg2+、Cd2+則對多數(shù)角蛋白酶有著抑制作用。DTT(二硫蘇糖醇)、β-Me(β-巰基乙醇)等還原劑能夠協(xié)助角蛋白酶加速角蛋白的降解,但是含二硫鍵的角蛋白酶在以其他含少量或者不含二硫鍵的蛋白質(zhì)為底物時(shí),需要注意其解酶二硫鍵的負(fù)效應(yīng)。

1.4 角蛋白酶氨基酸序列分子進(jìn)化樹

從NCBI下載了17個(gè)被報(bào)道過有角蛋白酶活性的蛋白序列,并使用MAGE6軟件下的鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖1可以看出這些角蛋白酶雖然分為兩個(gè)簇,但是Microsporumcanis和Pseudomonasaeruginosa來源的角蛋白酶和該簇里的其他角蛋白酶基因有著十分疏遠(yuǎn)的親緣關(guān)系,所以在整體上看來存在三個(gè)簇,并且這三個(gè)簇在一定程度上符合角蛋白酶按照活性中心分類的結(jié)果。芽孢桿菌屬來源的角蛋白酶都集中在一個(gè)簇里面,但是Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis來源的角蛋白酶與其他芽孢桿菌來源的角蛋白酶卻有著明顯的進(jìn)化差異,這點(diǎn)在多序列對比時(shí)也有發(fā)現(xiàn)(多序列對比結(jié)果未給出),所以在篩選一個(gè)未知的芽孢桿菌角蛋白酶基因時(shí),根據(jù)這兩個(gè)分支,至少需要設(shè)計(jì)兩套兼并引物,才能準(zhǔn)確的鎖定這些角蛋白酶基因。

圖1 部分角蛋白酶氨基酸序列分子系統(tǒng)樹Fig.1 Molecular phylogenetic tree of partial keratinase amino acid sequences注:數(shù)字為置信度,僅顯示70%以上的置信度。

2 角蛋白酶的生產(chǎn)

一般條件下野生型產(chǎn)角蛋白酶菌株的酶產(chǎn)量都很低,即便通過優(yōu)化培養(yǎng)基的手段,產(chǎn)量提升也不是很明顯,而且這些菌株對于生長環(huán)境的要求也比較高。蔣彪等[25]通過響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基,僅使野生菌株Bacillussp產(chǎn)酶量提升了20.74%,并且由于天然蛋白酶熱穩(wěn)定性較差以及野生菌株分泌的雜蛋白多而難以純化,直接導(dǎo)致了野生型菌株發(fā)酵生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益低的結(jié)果。目前這些不足均可利用基因工程技術(shù)解決,通過對角蛋白酶基因的改造,能提高角蛋白酶穩(wěn)定性和產(chǎn)量,攜帶融合標(biāo)簽的角蛋白酶也更利于純化,此外底物特異性的改造,使得角蛋白酶的應(yīng)用更加具有針對性。“利用基因工程酵母生產(chǎn)角蛋白酶的中試研究”曾被列為“十五”國家科技攻關(guān)項(xiàng)目,由此可見角蛋白酶基因工程研究的重要性。

2.1 選擇合適的表達(dá)宿主

有活性的蛋白酶的表達(dá)往往會(huì)影響宿主的生長,胞內(nèi)表達(dá)影響更大。比如大腸桿菌作為基因工程中最常用的表達(dá)宿主,在進(jìn)行蛋白酶胞內(nèi)表達(dá)時(shí),往往會(huì)出現(xiàn)大腸桿菌生長被抑制甚至菌體死亡或者包涵體表達(dá)等情況,針對這一情況,可以使用含有N端信號(hào)肽的質(zhì)粒,使角蛋白酶定位到大腸桿菌周質(zhì)空間,降低毒性。劉伯宏等[26]利用pET-22b(+)將來源于BacilluslicheniformisBBE11-1的角蛋白酶基因在大腸桿菌中成功表達(dá),并在胞外檢測到酶活,證實(shí)了利用大腸桿菌分泌表達(dá)角蛋白酶的可行性。畢赤酵母和枯草芽孢桿菌在分泌表達(dá)角蛋白酶時(shí)優(yōu)勢更加突出,畢赤酵母擁有完善的分泌表達(dá)體系，能夠使異源蛋白正確折疊,能完全分泌至胞外,而且酵母表達(dá)系統(tǒng)的糖基化作用還能夠提高酶的工作穩(wěn)定性[27],但過度的糖基化可能會(huì)導(dǎo)致酶特異性的改變;枯草芽孢桿菌也具有較為完整的蛋白質(zhì)折疊分泌機(jī)制,在表達(dá)來源于芽孢桿菌屬的角蛋白酶基因時(shí)基本不存在密碼子偏好性問題,這使得芽孢桿菌屬來源的角蛋白酶能在枯草芽孢桿菌宿主中實(shí)現(xiàn)超表達(dá)[28]。

總而言之,在表達(dá)一個(gè)角蛋白酶基因時(shí),針對宿主對外源蛋白的排斥性以及宿主的密碼子偏好問題,可以考慮選擇與基因來源菌親緣關(guān)系更加接近的宿主來表達(dá)這些角蛋白酶。馬怡茗等[29]利用大腸桿菌表達(dá)來源于StreptomycesalbidoflavusFea-10的角蛋白酶失敗后,使用同屬的StreptomycespactumACT12卻能成功表達(dá)。那么我們可以進(jìn)一步想到角蛋白酶產(chǎn)生菌自身未嘗不是一個(gè)極佳的表達(dá)宿主,一個(gè)BacillusamyloliquefaciensK11來源的角蛋白酶基因先后在BacillussubtilisSCK6和自身中轉(zhuǎn)化表達(dá),在后者中發(fā)現(xiàn)了更高的胞外酶活性[30]。

現(xiàn)在更多的表達(dá)宿主被人們發(fā)現(xiàn),人們也在嘗試使用這些新型宿主用于角蛋白酶的表達(dá)。如Huang M等[31]首次使用昆中細(xì)胞Spodopterafrugiperda(Sf9),成功表達(dá)了來自BacilluslicheniformisPWD-1的角蛋白酶基因,為人們提供了一個(gè)新的表達(dá)思路。

2.2 角蛋白酶基因的改造

提高表達(dá)量的改造:主要是密碼子優(yōu)化的手段,密碼子偏好性問題是蛋白異源表達(dá)時(shí)的一個(gè)嚴(yán)重障礙,往往導(dǎo)致目標(biāo)蛋白產(chǎn)量低,甚至在連續(xù)稀有密碼子存在的情況下蛋白不表達(dá),那么根據(jù)宿主的密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化,就成為了一個(gè)提高角蛋白酶異源表達(dá)效率的重要手段,尤其是對于連續(xù)的稀有密碼子的優(yōu)化,可以明顯提升表達(dá)量[32]。其次前肽的切割對蛋白的分泌表達(dá)有著重要影響,通過優(yōu)化切割位點(diǎn),可以加快蛋白的成熟與分泌[33]。

提高熱穩(wěn)定性的改造:在認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系后,蛋白酶的定向進(jìn)化越來越被人們所重視,相比非理性突變,準(zhǔn)確率高,操作量更小,常用于蛋白酶穩(wěn)定性和底物特異性的改造。在已知或者通過同源建模模擬得到角蛋白酶三維結(jié)構(gòu)后,利用蛋白熱力學(xué)分析軟件分析相關(guān)氨基酸殘基位點(diǎn),在活性中心外的區(qū)域,通過引入氫鍵、離子鍵、二硫鍵以及脯氨酸替換的方式,得到熱穩(wěn)定性更高的角蛋白酶。但是氫鍵[34]和離子鍵[35]這些弱相互作用力的引入,對于改造酶的效果往往與環(huán)境有很大的關(guān)系,并受到多種條件的影響,并且對于其原理也沒有完全弄清,需謹(jǐn)慎使用。而二硫鍵的引入和脯氨酸替換則是較為理想簡單的途徑,二硫鍵的引入能夠提高角蛋白酶的解鏈溫度[36];脯氨酸替換則是利用空間阻位較大的脯氨酸(還有酪氨酸等)取代空間阻位較小氨基酸,來限制蛋白酶局部運(yùn)動(dòng),維持構(gòu)象,提高角蛋白酶熱穩(wěn)定性[30,37],也有報(bào)道稱這樣可以降低酶的自溶[38]。

底物特異性的改造:底物特異性改造對于角蛋白酶的應(yīng)用十分重要,角蛋白酶底物廣在一般情況下是優(yōu)點(diǎn),但在有些情況下,也是不足,比如在皮革脫毛的過程中,過高的膠原蛋白酶活性就會(huì)使其應(yīng)用價(jià)值大大降低,而底物特異性的改造就能解決這一難題。目前在枯草桿菌蛋白酶中已有一定的進(jìn)展,人們發(fā)現(xiàn)枯草桿菌蛋白酶中底物結(jié)合區(qū)的空間阻位和靜電分布與其底物特異性密切相關(guān),其中S1,S4底物結(jié)合區(qū)起到主要作用,所以針對S1,S4底物結(jié)合區(qū)的改造研究成為重點(diǎn),主要是使用不同疏水性或不同側(cè)鏈大小的氨基酸替換關(guān)鍵位點(diǎn)[39]。 Estell等[40]將S1底物結(jié)合區(qū)最底部的Gly166用12種不同的疏水氨基酸取代,發(fā)現(xiàn)S1區(qū)疏水性的增加更利于酶與疏水性P1底物的結(jié)合。方真等[41]發(fā)現(xiàn)S1口袋中位于中間位置的Tyr215對于角蛋白酶的催化功能有著重要影響,該位點(diǎn)的疏水性增加,對應(yīng)的角蛋白酶活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,側(cè)鏈空間大小的增加(口袋的縮小)則導(dǎo)致其對于P1位氨基酸殘基較小的底物酶活增加;劉伯宏等[37]通過在S4底物結(jié)合區(qū)通過增大(M134A)和縮小(I106F)結(jié)合口袋大小,得到了對于天青角蛋白活性提升的正突變子,但是兩者的組合突變不僅沒有得到疊加效果,反而失去了對于天青角蛋白的活性。不同構(gòu)象的底物口袋對應(yīng)著不同底物,所以改造的前提是了解不同底物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),然后在一個(gè)合理的范圍內(nèi)改造。

目前需要更多關(guān)于熱穩(wěn)定性和底物特異性改造的研究,建立一個(gè)突變庫,包含提高穩(wěn)定性以及改變底物特異性的位點(diǎn),使角蛋白酶的改造變得更加方便快捷準(zhǔn)確,讓其應(yīng)用價(jià)值最大化。

表2 角蛋白酶基因的改造Table 2 The gene modification of keratinase

3 角蛋白酶的應(yīng)用及其作用機(jī)制

角蛋白的降解過程可分為兩步,二硫鍵的斷裂和肽鏈的水解,這兩個(gè)步驟相輔相成,互相促進(jìn)。二硫鍵的打開,肽鏈變得松散,其上的酶切位點(diǎn)暴露,有利于角蛋白酶快速降解角蛋白。

3.1 二硫鍵的還原

角蛋白酶負(fù)責(zé)水解肽鏈,卻無法對二硫鍵起作用,所以在微生物利用角蛋白的過程中,其分泌的能夠還原二硫化物的輔助因子(如二硫化物還原酶)起著關(guān)鍵性的作用。當(dāng)微生物作用于羽毛過程中，羽毛降解的同時(shí)伴隨著培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的積累(二硫鍵先經(jīng)過還原斷裂，其后再經(jīng)過一系列的氧化還原反應(yīng))[42]；以及二硫鍵還原酶和角蛋白酶混合處理角蛋白時(shí)，水解速度是單一角蛋白酶處理的50倍[6],這兩個(gè)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)充分證實(shí)了輔助還原因子在降解角蛋白時(shí)的重要性。

3.2 疏水氨基酸的切割

角蛋白酶能夠特異性降解角蛋白,而一般蛋白酶卻沒有此能力。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),是由于角蛋白表面富含疏水氨基酸殘基,一般蛋白酶幾乎“無從下手”,而角蛋白酶卻有著極強(qiáng)的疏水氨基酸殘基的切割能力,對于富含疏水氨基酸殘基的蛋白質(zhì),有著很好的親和力。以合成短肽作為底物,有研究發(fā)現(xiàn)角蛋白酶對于疏水氨基酸含量高的肽鏈的親和力明顯高于疏水氨基酸含量低的,并能高效切割 P1(對應(yīng)S1底物口袋)位點(diǎn)為芳香族氨基酸和疏水氨基酸的氨基酸殘基[43-44],導(dǎo)致外部疏水區(qū)的瓦解,內(nèi)部的水解位點(diǎn)暴露,角蛋白降解加快,在還原因子的作用下完全降解。而用角蛋白酶預(yù)處理羽毛后,無角蛋白酶活性的蛋白酶能夠在合適的還原劑下繼續(xù)降解角蛋白[3],也說明了角蛋白酶切割疏水氨基酸的特異能力是其區(qū)別于其他蛋白酶的重要特征。

4 角蛋白酶的應(yīng)用

4.1 飼料中的應(yīng)用

角蛋白酶可以將羽毛、羊毛等角蛋白廢棄物加工降解成動(dòng)物可消化吸收的多肽和氨基酸,綠色安全且更利于動(dòng)物消化利用[45]。飼料中蛋白成分復(fù)雜,由于其底物廣,角蛋白酶可以代替多數(shù)的蛋白酶被添加到飼料中;且角蛋白酶還有降解飼料中朊病毒的能力。

4.2 藥物輔助劑

灰指甲的感染部位在指甲下面,目前很多藥物由于滲透性低導(dǎo)致效果并不理想,而添加角蛋白酶作為滲透劑可增強(qiáng)藥物效果[46]。在藥品中添加角蛋白酶可用于皮膚角質(zhì)增生引起的雞眼和老繭等皮膚問題[47]。同時(shí)角蛋白酶可以作為治療痤瘡藥物添加劑[48]。產(chǎn)自人體腐生真菌的角蛋白酶會(huì)是較好的選擇。

4.3 朊病毒的降解

具有致病能力的朊病毒具有高度的β-折疊結(jié)構(gòu),類似于羽毛角蛋白,結(jié)構(gòu)頑固。角蛋白酶能夠在溫和條件下降解朊病毒對手術(shù)器械進(jìn)行消毒[49],使器械免受損傷。

4.4 動(dòng)物皮毛制造

皮革制造過程中傳統(tǒng)脫毛處理污染嚴(yán)重[50],然而角蛋白酶的出現(xiàn),將會(huì)解決脫毛過程中帶來的化學(xué)污染問題。特別是一些無膠原蛋白酶活性的角蛋白酶,非常適用于皮革脫毛工藝[20]。

角蛋白酶能夠優(yōu)先水解角質(zhì)層的作用,不僅能夠改良了羊毛氈縮效果,還能防止其內(nèi)部纖維的水解[51-52]。

4.5 去垢劑添加劑

角蛋白酶可以被添加到洗滌劑中,用來清除衣物上的血漬、食物殘留以及袖口和領(lǐng)口的角質(zhì)污漬[53];含有角蛋白酶的疏通劑則可以疏通由頭發(fā)引起的浴室管道堵塞等。

4.6 食品行業(yè)中的應(yīng)用

角蛋白中含有豐富的呈味氨基酸,可使用角蛋白酶降解角蛋白生產(chǎn)鮮味劑,安全節(jié)能,同時(shí)經(jīng)過角蛋白酶處理后的水解液還可以作為提鮮劑加入到面包、罐頭等食物中,來增強(qiáng)口感與營養(yǎng)。另外,角蛋白酶還可以用于肉制品嫩化、蠶絲脫膠以及燕窩脫毛[54]。

4.7 在其他方面的應(yīng)用

利用角蛋白酶來處理醫(yī)院廢棄的膠片,完整地回收纖維素酯基地[55];可以用角蛋白酶處理廢棄的角質(zhì)來獲得廉價(jià)的氮肥;還有研究發(fā)現(xiàn)角蛋白酶可來殺死南方根結(jié)線蟲,具有生物農(nóng)藥的潛力[56]?？傊?由于底物廣,角蛋白酶可以應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域,并且其獨(dú)有的角質(zhì)降解能力,使其在蛋白酶中脫穎而出,今后將會(huì)成為人們在蛋白酶領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。

5 展望

角蛋白酶不僅可以綠色安全的處理日益增多的解蛋白廢棄物，并且由于角蛋白酶底物廣的特性，可以將其推廣到我們生活中的每一處,從洗滌劑到藥物,從動(dòng)物飼料到人的營養(yǎng)品都將有角蛋白酶的蹤跡,而如何高產(chǎn)角蛋白酶以及提高角蛋白酶的工作性能是這一切的關(guān)鍵。目前國內(nèi)外有關(guān)角蛋白酶的研究依舊存在著一些問題,比如角蛋白酶活性測定仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致多種角蛋白酶的性質(zhì)毫無對比價(jià)值;國內(nèi)的角蛋白酶生產(chǎn)依舊使用野生菌株發(fā)酵,難以獲得純度高、安全系數(shù)高的角蛋白酶;產(chǎn)品定位低,與國外已經(jīng)商業(yè)化的角蛋白酶品牌(Bioresource International和Proteos Biotech早已推出多種針對不同用途的高檔角蛋白酶產(chǎn)品)相比相差甚遠(yuǎn);再者由于成本原因,利用角蛋白酶大規(guī)模綠色降解角蛋白的例子也鮮有耳聞,而多數(shù)是利用微生物降解,產(chǎn)品雜質(zhì)多,質(zhì)量差;而且目前應(yīng)用較多的均是來源于芽孢桿菌屬的角蛋白酶,對于真菌和放線菌來源的應(yīng)用研究較為少見,很大程度上限制了角蛋白酶的開發(fā)。因此應(yīng)該加快對各類角蛋白酶的生產(chǎn)研究和角蛋白酶解工藝的探索,并使用固定化酶等手段使角蛋白酶能夠重復(fù)使用,DMA(二甲基乙酰胺Dimethylacetamide)[57]、NPC-PEG(硝基苯酚碳酸酯-聚乙二醇Nitrophenolcarbonate-Polyethylene Glycol)[58]等化學(xué)劑對于角蛋白酶的化學(xué)修飾作用能夠提升酶的熱穩(wěn)定性,后期研究是否能夠?qū)⑦@種化學(xué)修飾和固定化技術(shù)結(jié)合起來,節(jié)省成本的同時(shí)提升穩(wěn)定性,這將是未來角蛋白酶化學(xué)修飾方面的另一研究方向。