蠶豆納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)

,,*, ,文剛

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海西寧 810016;2.青海省農(nóng)林科學(xué)院,青海西寧 810016;3.青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海西寧 810016)

納豆(natto)是一種源于日本且歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1],具有多種醫(yī)療保健功效[2],其中包括防止骨質(zhì)疏松、抗致病菌、促凝血、延緩衰老等,受到廣大學(xué)者的特別重視。納豆激酶(Nattokinase,NK)作為納豆發(fā)揮保健功效的主要功能因子,其顯著的降血栓功能使其成為當(dāng)前納豆研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。目前已有很多相關(guān)報(bào)道證實(shí)納豆激酶的功能特性主要表現(xiàn)為溶栓作用[3-4],同時(shí)納豆激酶具備高安全性、低成本、經(jīng)口服后能夠迅速入血[5]及在胃腸中具有良好穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[6-9],因而納豆激酶作為新一代的溶栓藥物[10-11]具有廣闊的開發(fā)前景。

蠶豆俗稱胡豆、南豆、羅漢豆、佛豆、川豆、寒豆和利馬豆等[12],蠶豆?fàn)I養(yǎng)豐富,其淀粉及蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低,是一種糧食、蔬菜和飼肥兼用的作物[13-14]。與傳統(tǒng)發(fā)酵納豆的原料黃豆相比,蠶豆含有豐富的淀粉、脂肪含量低,更利于納豆枯草芽孢桿菌的生物利用,無需外加碳源物質(zhì)就能達(dá)到高效發(fā)酵,同時(shí)改善其原有的風(fēng)味和口感。目前,有少量學(xué)者以蕓豆[15]、紅豆[16-17]、黑豆[18-19]和鷹嘴豆[20-21]作為納豆發(fā)酵主要原料開發(fā)新型保健產(chǎn)品,其納豆激酶活力及口感均得到一定程度的改善。李宏梁等[15]以蕓豆為原材料,研究蕓豆納豆最佳發(fā)酵工藝條件,結(jié)果表明,蕓豆用3倍的水浸泡10 h,加入0.5% NaCl,蒸汽滅菌鍋內(nèi)121 ℃下蒸煮35 min,冷卻至45 ℃以下進(jìn)行接種,接種量為9%,37 ℃下發(fā)酵20 h,溫度4 ℃下老化24 h,其感官評(píng)定值達(dá)到9.6分。王琳等人以紅豆為原料,應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化紅豆納豆的發(fā)酵工藝。結(jié)果表明,紅豆納豆最佳發(fā)酵條件為接種量6%、接種種齡18 h、發(fā)酵時(shí)間21.5 h,在此發(fā)酵工藝條件下,感官評(píng)分為97.7分,納豆激酶酶活力為1140 U/g[17]。而以蠶豆為材料發(fā)酵納豆的相關(guān)研究報(bào)道甚少,至今未見蠶豆在納豆食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。另外,當(dāng)前蠶豆的主要加工方式多以油炸蠶豆的休閑食品為主,其加工水平低,產(chǎn)品花樣少,產(chǎn)品檔次低,其價(jià)值沒有得到合理的開發(fā)與利用。

因此,本研究旨在創(chuàng)新蠶豆納豆發(fā)酵工藝,開發(fā)新型納豆產(chǎn)品,解決蠶豆產(chǎn)品加工單一難題,提高納豆激酶活力,同時(shí)探明蠶豆發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的酶學(xué)特性,為后續(xù)蠶豆—納豆激酶產(chǎn)品進(jìn)一步加工及利用奠定基礎(chǔ),指導(dǎo)蠶豆健康消費(fèi)方面具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青海GF47蠶豆 綠子葉、干蠶豆,儲(chǔ)存期1年,由青海作物育種栽培研究所蠶豆研究室提供;納豆枯草芽孢桿菌BSCZ-4 實(shí)驗(yàn)室誘變保存菌株[9];尿激酶(5 KU) 購自北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；凝血酶(1000 U/支)、牛纖維蛋白原 購自Sigma公司;其余試劑 均為分析純。菌種培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基 蛋白胨5.0 g,牛肉膏3.0 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水1.0 L,pH7.0。

101A-2ET電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)室儀器廠有限公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;BCD-649WE冰箱 輕道海爾股份有限公司;SW-CJ-2D型(實(shí)用垂直新穎)雙人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;KG-SX-500電熱手提高壓消毒器 KAGOSHIMA SEISAKUSYO IMC;AL204電子天秤 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;DL-5M低俗冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;BDP-207C超低有機(jī)物型純水機(jī) 南京權(quán)申生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備 參照文獻(xiàn)[22-23]的方法,用接種環(huán)挑取BSCZ-4斜面菌種兩環(huán),接種于裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)15 h。

1.2.2 蠶豆納豆發(fā)酵工藝流程 蠶豆→挑選→清洗→常溫浸泡→瀝干→常壓蒸煮→冷卻→接種→發(fā)酵→后熟→成品

挑選、清洗:選用蠶豆飽滿、去除殘豆、雜豆、泥土,清洗后用紗布瀝干;后熟:將發(fā)酵后的蠶豆納豆放置于4 ℃冰箱,放置24 h。

1.2.3 粗酶液的制備 參照張杰等[24]的方法。將發(fā)酵后的蠶豆納豆按1∶2 (g/g)加入生理鹽水,4 ℃下浸提24 h。并在4500 r·min-1條件下離心20 min,上清液即為納豆激酶粗酶液。

1.2.4 納豆激酶酶活力值測定 采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[25],并結(jié)合文獻(xiàn)[9]的方法測定酶活力值。得到尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.003x+0.3937,相關(guān)系數(shù)R2=0.9976。式中:y為溶解圈面積,x為酶活力值。

1.2.5 蠶豆納豆發(fā)酵工藝單因素實(shí)驗(yàn) 取GF47蠶豆,在浸泡時(shí)間為48 h、常壓蒸煮20 min、接種量8%、37 ℃下培養(yǎng)60 h的恒定條件下,分別考察接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、浸泡時(shí)間(18、24、30、36、42、48 h)、蒸煮時(shí)間(10、15、20、25、30 min)、發(fā)酵溫度(31、34、37、40、43 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(24、36、48、60、72 h)對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以感官評(píng)分及納豆激酶酶活力為指標(biāo),采用L9(34)正交試驗(yàn)法對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件中接種量、蒸煮時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 感官評(píng)定 采用評(píng)分法進(jìn)行感官評(píng)定,以發(fā)酵得到的蠶豆納豆產(chǎn)品的拉絲情況、氣味、顏色和口感為評(píng)定指標(biāo),組織10名(5男5女)經(jīng)過基礎(chǔ)培訓(xùn)的人員對(duì)蠶豆納豆產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)分,取平均值,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 納豆感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of natto

1.2.8 蠶豆納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.8.1 熱穩(wěn)定性 將制備得到的粗酶液置于不同溫度(25、30、40、50,60、70 ℃)的水浴中,在此條件下保溫3 h,以25 ℃保溫3 h的酶活力為100%,測定并計(jì)算其相對(duì)酶活[26]。

1.2.8.2 保溫時(shí)間穩(wěn)定性 將制備得到的粗酶液在40 ℃的水浴中保溫不同時(shí)間(30、60、90、120、150、180 min),以最高的酶活力為相對(duì)酶活100%,測定并計(jì)算出其相對(duì)酶活[26]。

1.2.8.3 pH穩(wěn)定性 將粗酶液加入到等體積不同pH(4、5、6、7、8、9、10、11)的緩沖液中,并在室溫下孵育24 h,以其中最高酶活力時(shí)為100%,測定并計(jì)算出其相對(duì)酶活[26]。

1.2.8.4 金屬離子穩(wěn)定性 將900 μL粗酶液分別與50 mmol/L的Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+溶液100和20 μL混合,加蒸餾水補(bǔ)充至1 mL,即配成含金屬離子5和1 mmol·L-1的酶液。將配制好的酶液置于37 ℃下孵育18 h,以無金屬離子的納豆激酶酶活為100%,測定得到相對(duì)酶活[26]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。數(shù)據(jù)用DPS 6.5進(jìn)行方差分析和多重比較,以p<0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 接種量對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響 由圖1可知,隨著接種量的增加,納豆激酶活力及感官評(píng)分均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)接種量<4%時(shí),納豆激酶酶活力及感官評(píng)分均相對(duì)較低,這主要是由于接種量小,使得接入的納豆枯草芽孢桿菌菌數(shù)少,生長緩慢、發(fā)酵遲緩,從而導(dǎo)致蠶豆納豆粘度較低、拉絲較少,納豆外觀無色澤,咀嚼香味不濃郁,產(chǎn)酶活力低;而當(dāng)接種量>8%時(shí),菌株生長過快,且菌株之間相互影響,加之蠶豆表面產(chǎn)生粘稠物質(zhì)阻礙菌株供養(yǎng),此時(shí)不利于菌株的生長和發(fā)酵,致使產(chǎn)酶活力降低[9]、發(fā)酵物相互黏連成塊、感官較差。綜上所述,選擇4%、6%和8%的接種量作為下一步正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖1 接種量對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響Fig.1 Effects of inoculum on fermentation process of natto by broad bean注:圖中小寫字母不同表示同一指標(biāo) 差異顯著(p<0.05),圖2～圖8同。

2.1.2 浸泡時(shí)間對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響 蠶豆的浸泡時(shí)間對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程有著重要的影響,由圖2可知,隨著浸泡時(shí)間的增長,納豆激酶活力值及感官評(píng)分呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì),48 h后趨于穩(wěn)定。當(dāng)浸泡時(shí)間為48 h時(shí),此時(shí)酶活力最大,為(3400.52±124.54) U·g-1,感官評(píng)分為(85.22±0.83)分。這是由于當(dāng)蠶豆浸泡時(shí)間過短,其籽粒過硬,致使蠶豆納豆口感較差、不酥軟,同時(shí)由于水分不充足,對(duì)于納豆枯草芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)生一定抑制[15],酶活較低;當(dāng)浸泡48 h后,蠶豆達(dá)到充分浸泡,繼續(xù)浸泡產(chǎn)酶活力及感官評(píng)分趨于穩(wěn)定。由多重比較分析結(jié)果可知,浸泡時(shí)間達(dá)48 h后酶活力無顯著差異,據(jù)此確定出正交試驗(yàn)中浸泡時(shí)間為48 h。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響Fig.2 Effects of soaking time on fermentation process of natto by broad bean

2.1.3 蒸煮時(shí)間對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響 蒸煮時(shí)間對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響如圖3所示,隨著蒸煮時(shí)間的增加,蠶豆籽粒由硬變軟,其納豆激酶活力及感官評(píng)分呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)蒸煮時(shí)間為20 min時(shí)發(fā)酵所得的納豆激酶酶活力值最高,為(3382.14±375.363) U·g-1,此時(shí)感官品質(zhì)相對(duì)較高,其感官評(píng)分達(dá)到(85.96±1.59)分。而當(dāng)蒸煮時(shí)間過長,其營養(yǎng)物質(zhì)損失較多,發(fā)酵產(chǎn)物較少,結(jié)合多重比較的結(jié)果,選擇15、20和25 min為正交試驗(yàn)水平。

圖3 蒸煮時(shí)間對(duì)納蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響Fig.3 Effects of cooking time on fermentation process of natto by broad bean

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響 微生物在發(fā)酵產(chǎn)酶過程中,適宜的發(fā)酵溫度是保證酶活力的主要因素之一。由圖4可知,隨著發(fā)酵溫度的增高,納豆激酶酶活力及感官評(píng)分呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí),所得納豆激酶酶活力最大,為(3907.64±102.85) U·g-1。感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明,當(dāng)溫度37～43 ℃,發(fā)酵產(chǎn)物色澤鮮亮、口感酥軟、感官評(píng)分較高,此溫度范圍為納豆枯草芽孢桿菌最適溫度范圍,且此范圍內(nèi)納豆激酶酶活力也高于其他水平,因此綜合考慮,選擇37、40、43 ℃為正交試驗(yàn)水平。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on fermentation process of natto by broad bean

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響如圖5所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,納豆激酶活力值及感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵溫度為60 h時(shí),納豆激酶活力達(dá)到最大值,為(3851.14±228.66) U·g-1,此時(shí)感官評(píng)分為(88.78±3.07)分。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,感官評(píng)價(jià)分得分基本趨于穩(wěn)定。而當(dāng)進(jìn)一步增加發(fā)酵時(shí)長時(shí),納豆激酶的活力值又略微下降。這主要是由于發(fā)酵時(shí)間過短,蠶豆納豆口感不軟糯,納豆激酶活力低,其保健功效不理想,而發(fā)酵時(shí)間過長,納豆的氨味較為濃郁,影響其風(fēng)味。鑒于此,選擇發(fā)酵48、60、72 h作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響Fig.5 Effects of fermentation time on fermentation process of natto by broad bean

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇接種量、蒸煮時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間作為試驗(yàn)四因素,按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),確定最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表3、表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment

表4 正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal test

由正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析表4可知,接種量(A)、蒸煮時(shí)間(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響均達(dá)到極顯著水平(p<0.01),其中蒸煮時(shí)間對(duì)蠶豆納豆發(fā)酵工藝的影響最大,為決定性因素。蠶豆納豆發(fā)酵工藝的最優(yōu)組合為A2B2C2D3,即接種量為6%,蒸煮時(shí)間為20 min,發(fā)酵溫度為40 ℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果其最優(yōu)組合為A2B2C2D3,進(jìn)行多次重復(fù)性(n=3)驗(yàn)證性試驗(yàn),測得納豆激酶活力值為(4860.13±470.02) U·g-1,感官評(píng)分為(95.67±0.71)分,與傳統(tǒng)黃豆采用相同菌株發(fā)酵納豆激酶[24]相比極顯著(p<0.01)提高,所得到的正交試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確合理,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 蠶豆納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果分析

2.3.1 熱穩(wěn)定性分析 由圖6可知,蠶豆固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的納豆激酶在高溫下不穩(wěn)定,當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí),該酶活性下降迅速且差異顯著;當(dāng)溫度升至70 ℃時(shí),該酶相對(duì)酶活僅為19.41%;而當(dāng)溫度較低,在25～40 ℃時(shí),酶活損失較小且差異不顯著,40 ℃時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到90.05%以上。這可能是由于當(dāng)溫度過高時(shí),納豆激酶結(jié)構(gòu)受到破壞,致使酶失活[27]。因此,在后續(xù)納豆激酶的儲(chǔ)存和加工利用上,應(yīng)控制溫度40 ℃以下,減少其納豆激酶的損失。

圖6 溫度對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on nattokinase activity

2.3.2 保溫穩(wěn)定性分析 由圖7可知,在40 ℃下隨著保溫時(shí)間的延長納豆激酶的酶活力值逐漸降低,但整體下降趨勢(shì)較為平緩,當(dāng)保溫時(shí)間達(dá)到90 min時(shí),隨著時(shí)間的延長,納豆激酶酶活力值趨于穩(wěn)定,此時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到84.09%。根據(jù)多重比較的結(jié)果可知,保溫時(shí)間60 min后對(duì)納豆激酶活力無顯著影響,納豆激酶較為穩(wěn)定。

圖7 保溫時(shí)間對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.7 Effects of incubation time on nattokinase activity

2.3.3 pH穩(wěn)定性分析 由圖8可知,在pH6～9時(shí),蠶豆固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的納豆激酶活性相對(duì)比較穩(wěn)定,其相對(duì)酶活在89.05%～100%之間。而當(dāng)pH低于6時(shí),納豆激酶損失嚴(yán)重,pH為4時(shí),其相對(duì)酶活僅為28.11%;而當(dāng)pH高于9時(shí),納豆激酶活力值迅速下降。結(jié)果說明納豆激酶耐受pH具有選擇性,因此在后續(xù)加工、儲(chǔ)存時(shí),選擇pH6～9有助于保持納豆激酶活力。

圖8 pH對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.8 Effects of pH on nattokinase activity

2.3.4 金屬離子穩(wěn)定性分析 由表5可知,當(dāng)金屬離子濃度為1 mmol·L-1時(shí),Mg2+和Ca2+對(duì)蠶豆發(fā)酵得到的納豆激酶活力具有促進(jìn)作用;而當(dāng)金屬濃度增加至5 mmol·L-1時(shí),Mg2+和Ca2+對(duì)納豆激酶活力促進(jìn)增強(qiáng)。另外,Cu2+、Fe3+對(duì)納豆激酶活力具有抑制作用,隨著金屬離子濃度的增加抑制作用增強(qiáng);Zn2+對(duì)納豆激酶活性的影響無明顯作用。因此,在實(shí)際生產(chǎn)加工中,添加Mg2+和Ca2+可增強(qiáng)納豆激酶的穩(wěn)定性,降低納豆激酶活力的損失。

表5 金屬離子對(duì)納豆激酶活力的影響Table 5 Effects of metal ions on nattokinase activity

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)蠶豆固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳提取工藝為蠶豆浸泡時(shí)間為48 h,蒸煮時(shí)間為20 min,接種量為6%,發(fā)酵溫度為40 ℃,發(fā)酵時(shí)間為72 h,在此條件下,納豆激酶酶活力達(dá)到最高,為4860.13±470.02 U·g-1,感官評(píng)分為95.67±0.71分。該酶在25～40 ℃具有較好的熱穩(wěn)定性;pH在6～9范圍內(nèi)其酶較為穩(wěn)定,保持相對(duì)酶活89.05%以上;Mg2+和Ca2+對(duì)納豆激酶活性具有促進(jìn)作用,Cu2+、Fe3+抑制作用明顯,Zn2+無明顯作用。本研究為推廣蠶豆資源的利用,增加納豆新品種,開闊市場,提高其綜合加工利用率和附加值提供了重要的途徑。