云芝與槐耳抗氧化活性評價及低極性組分GC-MS成分分析

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(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010)

多孔菌科隸屬高等擔(dān)子菌非褶菌目,是有重要經(jīng)濟價值的真菌類群[1]。該科真菌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣,有多糖[2]、萜類[3]、甾體[4]、生物堿、脂肪酸和苯醌類等多種結(jié)構(gòu)類型。這些代謝產(chǎn)物多具有抗腫瘤、抗炎和抗病毒等[5-6]生物活性。因此,該科中可用于醫(yī)藥保健的藥食類真菌一直都受到廣泛關(guān)注,如靈芝(Ganodermalucidum),茯苓(Wolfiporiacocos)和豬苓(Polyporusumbellatus)等。

近年來,該科栓菌屬的云芝(Coriolusversicolor)和槐耳(Trametesrobiniophila)在醫(yī)藥保健品開發(fā)中逐漸進入公眾視野,現(xiàn)已證實這兩種真菌在抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等方面均具有一定功效。Wei等[7]曾報道槐耳對人腎臟786-O腫瘤細胞的存活率,侵襲和遷移有明顯的抑制;Wang等[8]發(fā)現(xiàn)槐耳可通過促進自噬溶酶體途徑達到治療炎癥的目的;而Saleh等[9]報道云芝對多種免疫細胞具有促進作用?，F(xiàn)市場上已有根據(jù)以上功效開發(fā)的醫(yī)藥保健產(chǎn)品,如槐耳顆粒[10]和云芝肝泰顆粒,前者能有效抑制腫瘤細胞的生長與繁殖;后者是一種免疫調(diào)節(jié)劑,可治療慢性肝炎。

除抗腫瘤和免疫功效外,抗菌和抗氧化活性近期也成為研究熱點,特別是天然來源產(chǎn)品,日益成為食品工業(yè)的重要添加劑和醫(yī)藥工業(yè)原料[11-12]。但目前云芝和槐耳的活性研究卻較少涉及此方面,成分研究也集中于多糖及糖肽等大分子極性化合物[13]。根據(jù)文獻報道,栓菌屬多種真菌多具有較好的抗菌、抗氧化活性[14]。因此,本文探究云芝、槐耳兩種真菌的抗菌及其抗氧化活性,并用GC-MS(Gas chromatography-mass spectrometry)分析其低極性部位化合物組成,為擴大開發(fā)兩種菌的食醫(yī)藥用功效提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生云芝(Coriolusversicolor)、槐耳(Trametesrobiniophila)子實體 于2017年9月采自四川綿陽市北川縣,由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院菌物學(xué)教授賀新生鑒定；大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 由廣東微生物研究所提供；DPPH(1,1-二苯-2-苦肼自由基) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;正構(gòu)烷烴(C1～C31)標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 g·L-1) 美國Sigma-Supelco公司;維生素C 上海阿拉丁公司;無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯等 成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純;純水 為實驗室自制(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;BS223S型電子精密天平 德國賽多利斯;KQ-200KDE型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UV7200型可見分光光度計 龍尼柯(上海)儀器有限公司;MGC-250型光照培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;CR22G Ⅲ型高速冷凍離心機 日本日立。

1.2 實驗方法

1.2.1 云芝及槐耳子實體的預(yù)處理 將采得的云芝及槐耳子實體經(jīng)自然風(fēng)干并于50 ℃烘干后粉碎,過100目篩并于4 ℃保存待用,以下所有實驗在3周內(nèi)完成。

1.2.2 溶劑提取物制備 采用索氏抽提法,用85%乙醇按固液比1∶5 (g/mL)回流提取兩種菌體干燥粉末各50 g,2 h后過濾取上清液,濾渣繼續(xù)加相同量溶劑提取,重復(fù)3次后合并上清液并旋干,得乙醇提取浸膏。

參考王靜等方案[15]稍作修改,按照極性從小到大順序分別采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水對乙醇浸膏進行再提取。按照浸膏和提取溶劑質(zhì)量體積比1∶5進行超聲浸提,每次超聲20 min,過濾取上清液,反復(fù)3次后合并上清液,旋干得各種溶劑提取浸膏并稱量計算得率,公式如下:

各組分得率(%)=各溶劑部位提取浸膏質(zhì)量×100/乙醇提取浸膏質(zhì)量

1.2.3 抗氧化活性評價 抗氧化活性測定包括DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基、總還原力和鐵螯合能力測定等多種方法,在預(yù)實驗中筆者發(fā)現(xiàn)以上方法結(jié)果具有一致性。為方便試驗中活性的快速跟蹤,本試驗選用了較為簡便的DPPH自由基清除率實驗來進行抗氧化活性判定。

準(zhǔn)確稱取1.2.1步所得各溶劑浸膏10 mg,用乙醇超聲溶解定容至10 mL,得濃度為1.0 g·L-1的母液。利用移液槍進行稀釋,配制成0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g·L-1五個等間隔梯度測試用樣品液。

參考Elbadrawy等方法[16]稍作修改,在517 nm處測定吸光度值,以無水乙醇參比調(diào)零,測定0.0025 g·L-1的DPPH溶液吸光度值A(chǔ)0。然后分別將0.2～1.0 g·L-1五個梯度樣液以及0.2 g·L-1的VC溶液(陽性對照)與0.0025 g·L-1的DPPH溶液按體積比(1∶1)混合后,避光反應(yīng)20 min后測量其吸光度值,定為Ai。記錄下各個濃度樣品的吸光度值數(shù)據(jù),利用如下公式計算得出各提取部位的自由基清除率,從而對其抗氧化活性進行評價。本試驗每種溶液抗氧化活性平行測定3次,結(jié)果以平均值表示,清除率計算公式如下:

1.2.4 抗細菌活性評價 參考De等方法[17]稍作修改。分別取云芝和槐耳各溶劑提取部位的浸膏,以10%的DMSO配制成濃度梯度為5 g·L-1的樣品溶液備用,用時稀釋到0.5 g·L-1。

以大腸埃希菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為測試用菌,采用平板打孔法分別測定四種溶劑提取物的抗菌活性。具體操作方法如下:將所配制好的平板均分為兩組,一組用打孔器在每個平板上打六個均勻大小的孔,分別加入陽性對照樣品(新霉素)、陰性對照樣品(10% DMSO溶劑)以及相同濃度梯度下的四種萃取物樣品溶液各50 μL。每個樣品接種3個平板做重復(fù),最后將接種好的培養(yǎng)基放入光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),24 h后觀察各樣品溶液是否能產(chǎn)生抑菌圈并用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈大小,單位為mm。

1.2.5 石油醚提取物GS-MS分析 甲酯化:采用1%硫酸-甲醇加熱回流酯化法[18],稱取兩種菌體石油醚提取浸膏50 mg加入錐形瓶中。將1%硫酸和甲醇溶液按照體積比(1∶9)配制好后,用移液管移取2 mL加入。在80 ℃水浴條件下,將裝有反應(yīng)物的錐形瓶持續(xù)水浴加熱反應(yīng)80 min。完畢后取出錐形瓶冷卻至室溫后,加入2 mL正己烷,再加入蒸餾水5 mL,10000 r·min-1高速離心后吸出上清液,重復(fù)3次,合并上清液供GC-MS備檢。

GC分析條件:柱箱溫度:40.0 ℃,進樣溫度:290.00 ℃,壓力:49.5 kPa,總流量:14.0 mL·min-1,柱流量:1.00 mL·min-1,線速度:36.1 cm·s-1,吹掃流量:3.0 mL·min-1,分流比:10.0。其中溫控程序如表1。

表1 GC-MS溫控程序表Table 1 GC-MS temperature control program

保留指數(shù)(Kovats Index,KI)值測定:取正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品按照與樣品相同的條件分析,記錄每個正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間,數(shù)據(jù)代入線性升溫公式[19]計算各組分的KI值

KI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)

其中:tx、tn和tn+1分別為被測組分和碳原子數(shù)n和(n+1)的正構(gòu)烷烴(tn

MS程序:離子源溫度200.00 ℃,接口溫度220.00 ℃,溶劑延遲時間3.80 min,MS記錄時間:開始時間4.00 min,結(jié)束時間73.00 min,掃描速度:1428,開始m/z:33.00,結(jié)束m/z:700.00,樣品進樣單元:GC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理,實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組均數(shù)之間采用Duncan檢驗,檢驗結(jié)果用字母法表示,實驗重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取得率

利用85%乙醇對云芝和槐耳(各50 g)進行索氏抽提后分別得到云芝浸膏1.928 g和槐耳浸膏1.857 g。用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸餾水依次對以上兩種真菌的醇提浸膏進行超聲再浸提,各部分得率見表2,兩種菌體石油醚部分得率均最高,說明均含有較多的低級性化合物。

表2 各溶劑提取得率Table 2 The extraction yield of various solvent

2.2 抗氧化活性評價

從云芝和槐耳的四種溶劑提取物的DPPH自由基清除率數(shù)據(jù)(見表3)可知,清除率均隨樣品濃度的增加而增加,呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。云芝不同提取部位的抗氧化活性順序為正丁醇>乙酸乙酯>蒸餾水>石油醚;而槐耳不同提取部位抗氧化活性順序為乙酸乙酯>正丁醇>石油醚>蒸餾水。在0.2 g·L-1濃度時,所有樣品抗氧化活性均低于同濃度下的陽性對照抗壞血酸(VC),云芝各部位均高于槐耳,特別是乙酸乙酯和正丁醇部分抗氧化活性較高,可重點在這兩個部位中開發(fā)抗氧化活性物質(zhì)。

表3 四個萃取部位的DPPH自由基清除率Table 3 DPPH free radical scavenging rate of four extraction fractions

2.3 抗細菌活性評價

以新霉素為陽性對照,DMSO為陰性對照測試兩種菌的抗菌活性。在不同濃度下各提取部分對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的抑制情況見表4。

表4 兩種菌不同組分的抗菌活性Table 4 Antibacterial activity of different components from two mushrooms

由表4可知,云芝除石油醚組分有較弱的抑菌活性外其余組分均無明顯效果,槐耳的各個組分均無較強抑菌效果。兩種菌在抗細菌活性表現(xiàn)上均較差,不具抗菌開發(fā)價值。該實驗結(jié)果和Matijasevic等[20]報道略有不同,Matijasevic報道云芝甲醇提取物對大腸埃希菌的半數(shù)抑制濃度為20 mg/mL,而本文未測試出明顯的抑菌活性。經(jīng)文獻對比,確定可能有兩方面原因,一是所測試組分為醇提組分的再萃取產(chǎn)物;二是測定濃度較低,僅為0.5 mg/mL,以上兩原因造成實際測試濃度遠低于文獻報道,這就造成了活性偏低。

根據(jù)2.2～2.3活性測評結(jié)果,兩種真菌各組分抗菌活性均不高,但抗氧化活性表現(xiàn)較好。因GC-MS多用于測定低極性化合物,遂對云芝與槐耳石油醚部分進行GC-MS分析,后續(xù)試驗將采用HPLC-MS對中等極性和強極性部位的乙酸乙酯和正丁醇組分進行分析。

2.4 兩種菌石油醚萃取部分GC-MS結(jié)果分析

通過GC-MS分析經(jīng)甲酯化后的石油醚萃取部分,得到兩菌的離子流譜圖(圖1和圖2)和質(zhì)譜數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)云芝石油醚組分中含有27種化合物,槐耳則含有39種化合物。分別選取含量前10的化合物,結(jié)合KI值和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對比分析,得到表5化合物。

表5 兩種真菌石油醚組分GC-MS分析結(jié)果表Table 5 GC-MS analysis results of petroleum ether components from two mushrooms

續(xù)表

圖1 云芝石油醚部分GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS spectra of petroleum ether components from Coriolus versicolor

圖2 槐耳石油醚部分GC-MS圖譜Fig.2 GC-MS spectra of petroleum ether components from Trametes robiniophila

兩種真菌石油醚組分成分差異不大,主要是脂肪酸或固醇類物質(zhì)。云芝中含量最高為亞油酸甲酯(23.92%),它可以直接作用于呼吸道上皮細胞,調(diào)節(jié)黏液的基因表達、生產(chǎn)和分泌[21]。其衍生物亞油酸具有抗癌、抑制動脈粥樣硬化,減少體脂,同時改善瘦體重,調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)等活性[22-23]?；倍泻孔罡叩奈镔|(zhì)為油酸甲酯(22.43%),它增加雄激素敏感組織的重量和血漿睪酮水平[24]。共同含有的化合物有亞油酸甲酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、棕櫚酸甲酯、2-羥基-二十四酸甲酯和麥角甾14,22二烯-3-醇。其中,棕櫚酸甲酯對心臟、肝臟、肺都具有保護作用[25-26],而且還具有抗炎活性[27]。

3 結(jié)論及討論

通過實驗可知,云芝各組分抗氧化活性均高于槐耳,特別是其乙酸乙酯部位對DPPH自由基的抑制率達到了91.51%,而正丁醇部位也達到了90.24%,是可開發(fā)的良好原料。有文獻報道云芝中多糖具有抗氧化活性[28],但多糖屬于大分子,水溶性很強,較少存在于以上部位,因此可推斷這兩部分應(yīng)存在小分子活性單體化合物,還需后續(xù)研究進行證實。

GC-MS結(jié)果顯示兩種多孔菌科真菌的低極性部位化學(xué)成分比較相似,以多不飽和脂肪為主,主要包括亞油酸甲酯(云芝23.92%,槐耳4.29%),鄰苯二甲酸單乙基己基酯(云芝18.68%,槐耳9.60%)和2-羥基-二十四酸甲酯(云芝15.78%,槐耳15.54%)等。根據(jù)Peng[29]等報道人體多不飽和脂肪酸在宿主防御和免疫中發(fā)揮了多重關(guān)鍵作用,包括抗癌、抗炎、抗氧化活性,以及腸道致病菌的競爭。因此,雖然該部位抗氧化和抗菌活性較低,但兩種菌的低極性部位任可作為抗癌、抗炎等藥物生產(chǎn)的原料以備開發(fā)。