茯苓酸對(duì)小鼠病毒性心肌炎Caspase-3及Akt表達(dá)的相關(guān)研究；

陳偉光　張學(xué)峰　官瑩　王柏春

【摘要】目的觀察茯苓酸在BALB/c鼠病毒性心肌炎動(dòng)物模型中的療效以及對(duì)Caspase-3和Akt表達(dá)水平的影響。方法選擇BALB/c小鼠150只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、茯苓酸組共三組，每組50只。制備小鼠病毒.性心，肌炎模型后茯苓酸組腹腔注射茯苓酸提取液0.1mLg，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組分別給予腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.1mL/g，每日1次，連用15d。在第4、8、15d取出心臟，并進(jìn)行病理學(xué)檢查、Caspase-3及Akt蛋白表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果模型對(duì)照組小鼠心肌病理積分、心肌組織Caspase-3蛋白活性較正常對(duì)照組顯著升高，與模型對(duì)照組相比，茯苓酸組心肌病理積分顯著降低（P<0.05）;茯苓酸組Caspase-3表達(dá)活性相對(duì)較低，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;模型對(duì)照組Akt蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低（P<0.05），茯苓酸組Akt蛋白表達(dá)顯著高于模型組（P<0.05）。結(jié)論茯苓酸可能是通過(guò)上調(diào)Akt蛋白的表達(dá)，激活PI3-K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)改善病毒性心肌炎小鼠的心肌炎性和損傷。

【關(guān)鍵詞】茯苓酸;病毒性心肌炎;科薩奇病毒B3;Caspase-3;絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

中圖分類號(hào)：R542.2

文獻(xiàn)識(shí)別碼：A

文章編號(hào)：1009-816X（2019）06-050 1-04

doi：10.3969/j.issn.1009.-816x.2019.06.004

The Related Research of Pachymic Acid on the Expression of Caspase-3 and Akt in Mice with Viral Myocarditis. CHEN Wei-guang，ZHANG Xue-feng，GUAN Ying ，Wang Baichun. Department of Cardiovascular Surgery，The First Affiliated Hospital ofHarbin Medical Uniwersity，Harbin 150001，China

[ Abstract] Objective To observe the effect of pachymic acid on the expression of Caspase-3 and Akt in BALB/c mice with viral myocarditis. Methods 150 BALB/c mice were randomly divided into three groups： normal control group， model control group andpachymaric acid group， 50 mice in each group. After the mice model of viral myocarditis was made， the pachymaric acid group wasintraperitoneally injected with porialic acid extract 0.1mL/ g， normal control group and model control group were given normal salineintraperitoneal injection of 0.1mL/g once a day continuously for 15 days. On the 4th， 8th and 15th day， the heart was taken forpathological test and the detection of Caspase-3 activity and Akt protein expression. Results The myocardial pathological score and the activity of Caspase-3 protein in the model control group were significantly higher than those in the normal control group. Comparedwith the model control group， the myocardial pathological score in the pachymic acid group was significantly lower（ P<0.05）， theexpression activity of Caspase-3 in pachymic acid group was relatively low， but there was no significant difference between pachymicacid group and model group（ P > 0.05 ）. The expression of Akt protein in the model control group was significantly lower than that inthe normal control group（ P <0.05 ）， the expression of Akt protein in pachymic acid group was significantly higher than that in modelgroup（ P< 0.05 ）. Conclusions Pachymic acid can significantly improve the myocardial inflammation and injury in mice with viral my-ocarditis， and its mechanism may be up-regulating the expression of Akt protein and activating PI3-K/ Akt signal transduction pathway.

[ Key words ] Pachymic acid; Viral myocarditis; CoxsackievirusB3;Caspase-3; Akt

病毒性心肌炎（viralmyocarditis，VMC）是臨床常見(jiàn)疾病之一，在VMC的發(fā)生發(fā)展中，病毒直接感染損傷心肌，進(jìn)而又導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)激活造成自體心肌被自體免疫系統(tǒng)殺傷，心肌細(xì)胞壞死、凋亡，最終造成不可逆損害[1～3]。茯苓酸是存在于茯苓、靈芝等中藥材中的一種三萜類化合物，具有多種生物、化學(xué)作用[4]。研究表明，茯苓酸可以阻斷T細(xì)胞介異的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而降低CD8+淋巴細(xì)胞誘異的細(xì)胞凋亡[5]。本研究采用茯苓中提取三萜類化合物茯苓酸[3β乙酰氧基16a羥基羊毛甾8，24（31）二烯21酸，Pachymicacid，PA），觀測(cè)在BALB/c小鼠VMC動(dòng)物模型中的療效以及對(duì)Caspase-3和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）在VMC表達(dá)水平的影響，為臨床VMC的藥物治療提供新的依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料：由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK（黑）2013-021），4周齡健康雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠150只，體重15～17g;茯苓酸，自制，由鄭州大學(xué)檢測(cè)質(zhì)量合格，溶于二甲亞砜配制成1mg/mL的茯苓酸藥液;柯薩奇病毒B3（CVB）m株，Hep2細(xì)胞中傳代，CPE達(dá)75%時(shí)收獲，其滴度為107TCID50/0.1mL;Caspase-3試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。病理切片顯微鏡及分析系統(tǒng)：OlympusJVCTK-C1381彩色成像顯微鏡觀測(cè)、記錄數(shù)據(jù)MoticImages2000Version1.3軟件進(jìn)行分析。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：

1.2.1動(dòng)物分組及模型建立：將150只入選小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，每組50只。正常對(duì)照組：正常小鼠不給予病毒，每只小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.1mL/g;模型對(duì)照組：每只小鼠給予腹腔注射107TCID50（CVB）0.1mL/g，注射病毒2h后再注射0.9%氯化鈉溶液0.1mL/g;茯苓酸組：每只小鼠給予腹腔注射107TCID50（CVB）0.1mL/g，注射病毒2h后再注射茯苓酸藥液0.1mL/go以上小鼠腹腔注射柯薩奇病毒3d，藥物治療15d，記錄小鼠15d內(nèi)生長(zhǎng)情況。小鼠在造模過(guò)程中可能出現(xiàn)死亡情況，為便于后.續(xù)實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行，分別于第4d、8d、15d從各組小鼠中隨機(jī)取出8只進(jìn)行考察，乙醚麻醉，分離出心臟待用。1.2.2-般情況觀察及死亡統(tǒng)計(jì)：自模型建立后，每天觀察各組小鼠的精神、食欲、活動(dòng)及其他癥狀，記錄每組死亡小鼠的時(shí)間及數(shù)量。

1.2.3標(biāo)本采集及組織病理學(xué)檢測(cè)：在造模后的第4d、8d、15d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出小鼠心臟，觀察大體變化，將其分成兩部分，取少量組織用10%甲醛固定，用以制作光學(xué)顯微鏡檢測(cè)用標(biāo)本，其余心肌組織研磨形成單細(xì)胞液，并裂解其中心肌細(xì)胞。小鼠心臟切片行常規(guī)HE染色，光鏡顯微鏡下觀察小鼠心肌病理變化，每張切片取5個(gè)高倍視野，采用Rexkalla半定量分析法[6]計(jì)算每個(gè)視野下的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌壞死面積所占整個(gè)心肌面積百分比。心肌病變積分標(biāo)準(zhǔn)：炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌壞死>75%計(jì)4分，50%～75%計(jì)3分，25%～50%計(jì)2分，<25%計(jì)1分，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌壞死計(jì)0分。

1.2.4Caspase-3酶活性及Akt蛋白表達(dá)檢測(cè)：將小.鼠心肌組織加入裂解液，研磨成勻漿，離心，獲得總蛋白，按照Caspase-3酶活性檢測(cè)試劑盒相關(guān)步驟測(cè)定，加底物顯色后于405nm處繪制pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)采用酶標(biāo)儀測(cè)定相同波長(zhǎng)下樣品的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及光密度值計(jì)算樣品中Caspase-3酶活性;Akt蛋白表達(dá)采用Westernblotting法進(jìn)行檢測(cè)，BCA試劑盒測(cè)定小鼠心肌組織蛋白濃度后，與蛋白.上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，用PVDF膜對(duì)凝膠條塊進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1.5h后，分別加入兔抗多克隆-抗，4°C孵育過(guò)夜，洗膜4次，二抗室溫孵育1h，洗膜4次，于凝膠系統(tǒng)中曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率表示，采用x2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1小鼠死亡情況比較：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常對(duì)照組15d內(nèi)未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;模型對(duì)照組8d內(nèi)死亡9只，15d內(nèi)死亡16只，死亡率達(dá)到32.00%;茯苓酸組8d內(nèi)死亡6只，15d死亡7只，死亡率達(dá)到14.00%。對(duì)比各組小鼠15d內(nèi)死亡率情況，發(fā)現(xiàn)茯苓酸組小鼠死亡率顯著低于模型對(duì)照組（x2=4.57，P<0.05）。

2.2小鼠心肌組織病理學(xué)變化：觀察第15d各組小鼠心肌組織病理情況，結(jié)果顯示，正常對(duì)照組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1a見(jiàn)封三），模型對(duì)照組小鼠見(jiàn)心肌組織及心外膜下炎細(xì)胞浸潤(rùn)，大片的心肌壞死，溶解，鈣化（圖1b見(jiàn)封三），茯苓酸組小鼠心肌組織可見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌溶少，有橫紋，心肌纖維排列紊亂松散（圖1c見(jiàn)封三）。

采用Rezkalla半定量分析法評(píng)估小鼠心肌病變積分，模型對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)第4d，8d，15d心肌病變積分顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），但采用茯苓酸進(jìn)行治療后，茯苓酸組小鼠各時(shí)間段心肌病變積分相較模型對(duì)照組有所降低（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3小鼠心肌組織Caspase-3檢測(cè)結(jié)果比較：見(jiàn)表2。在實(shí)驗(yàn)第4d、8d、15d，模型對(duì)照組小鼠心肌組織Caspase-3活性較正常對(duì)照組顯著升高，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），茯苓酸組較模型對(duì)照組Caspase-3活性有所降低，但二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4小鼠心肌組織Akt蛋白表達(dá)水平比較：采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組小鼠心肌組織中Akt蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠第4d、8d、15d心肌組織中p-Akt蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），與模型對(duì)照組比較，茯苓酸組各時(shí)間點(diǎn)心肌組.織p-Akt蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表3。

3討論

VMC作為一種病毒感染性心肌炎性病癥，是引起青少年心力衰竭、心源性休克和猝死的主要原因[7，8]。對(duì)于VMC這種致死率較高的疾病，目前臨床上相關(guān)的有效治療方案較為有限，部分研究報(bào)道黃芪、虎杖等復(fù)方中藥對(duì)VMC的治療可能有效，但其具體作用機(jī)制尚不十分清楚，因此探究VMC的發(fā)病機(jī)制及有效治療手段仍是目前臨床醫(yī)學(xué)研究中關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

茯苓酸是存在于茯苓、靈芝等中藥材中的一種三萜類化合物，具有維持細(xì)胞穩(wěn)定、抗炎、抗腫瘤細(xì)胞等多種生物學(xué)作用[6，9，10]。劉宏宇等[11]證實(shí)茯苓酸可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制磷脂酶A2（PLA2）的生物活性，增加外周血中CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的數(shù)量，保護(hù)細(xì)胞，

免受損傷。本研究發(fā)現(xiàn)茯苓酸可明顯提高科薩奇B病毒3所致的病毒性心肌炎（CVB3-VMC）小鼠的生存率，同時(shí)其對(duì)CVB3-VMC小鼠的心肌細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞凋亡作為一種細(xì)胞程序性死亡在VMC的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程扮演著重要的角色。病毒感染后所致心肌細(xì)胞凋亡可引起心肌細(xì)胞丟失，最終導(dǎo)致心功能出現(xiàn)障礙[12]。盡管VMC引起的細(xì)胞凋亡機(jī)制目前尚不清楚，但已有研究表明，抑制心肌組織中Caspase-3的表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡具有一定的緩解作用。顏雯等[13]在CVB3感染的小鼠原代心肌細(xì)胞中加人雷米普利進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)感染病毒的心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低，且Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下降，進(jìn)一步揭示雷米普利抑制心肌細(xì)胞凋亡可通過(guò)下調(diào)Caspase-3的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定小鼠心肌組織中Caspase-3含量，結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠Caspase-3含量較正常對(duì)照組顯著升高，茯苓酸組小鼠Caspase-3含量較模型對(duì)照組有所下降，但是兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），探究原因，可能是茯苓酸在BALB/c小鼠這種活體動(dòng)物中對(duì)Caspase-3的調(diào)節(jié)無(wú)明顯作用，同時(shí)可能是因?yàn)闃颖玖刻?，?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不足以正確說(shuō)明問(wèn)題，因此茯苓酸對(duì)病毒性心肌炎小鼠的心肌保護(hù)是否通過(guò)抑制Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑來(lái)發(fā)揮作用仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

Akt是PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑中極其重要的靶蛋白，處于PI3K/Akt信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)[14]。在細(xì)胞代謝過(guò)程中，Akt與PIP3結(jié)合后，實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，Akt發(fā)生活化，活化后的Akt可通過(guò)磷酸化一系列下游靶蛋白來(lái)行使各種細(xì)胞功能，以此達(dá)到抑制.細(xì)胞凋亡的作用。本試驗(yàn)通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定各組小鼠心肌組織中Akt蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組小鼠心肌組織中p-Akt蛋白在實(shí)驗(yàn)第4d、8d、15d較正常對(duì)照組顯著降低，而在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)茯苓酸組小鼠心肌組織中p-Akt蛋白表達(dá)均顯著升高，組間.比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這說(shuō)明茯苓酸保護(hù)VMC小鼠的心肌損傷可能是通過(guò)上調(diào)Akt蛋白的表達(dá)，激活PI3～K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究初步證實(shí)，茯苓酸作為中藥茯苓中的一種有效活性成分，對(duì)VMC小鼠具有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與PI3-K/Akt信號(hào)中Akt蛋白表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，但因受實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量所限，上述結(jié)果還有待大樣本的試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：2019-4-9）