基于“腸外翻—心肌細(xì)胞”聯(lián)用模型的益氣活血方藥效學(xué)作用評(píng)價(jià)及機(jī)制探討

耿亞+楊洪軍+馬月香+張晶晶+張毅+李德鳳+張方博+許海玉

[摘要]該研究首先建立過(guò)氧化氫（H₂O₂）誘導(dǎo)大鼠胚胎心肌細(xì)胞株（H9c2）氧化損傷模型，并篩選出益氣活血方腸吸收液體外心肌保護(hù)作用的濃度范圍，優(yōu)選出4個(gè)劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；通過(guò)考察益氣活血方腸吸收液對(duì)H9c2的保護(hù)作用，從而為臨床防治與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)心臟疾病提供參考；并通過(guò)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等指標(biāo)進(jìn)行考察，對(duì)益氣活血方腸吸收液作用機(jī)制進(jìn)行初步評(píng)價(jià)探討。結(jié)果顯示，益氣活血方腸吸收液對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用，且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，可提高SOD的活性，減少M(fèi)DA的釋放，從而降低異常細(xì)胞的形成，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化能力，提高細(xì)胞活力，具有一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]益氣活血方； 心肌細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； MDA； SOD

[Abstract]This research firstly establishes the oxidative damage model of H9c2 induced by H₂O₂ and screens the concentration range of intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula which possess external myocardium protection function. Then， the thesis chooses 4 dosages to conduct experiments：examining the protection function of intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula on H9c2 to provide reference for clinical prevention and curing of relative heart diseases of oxidative stress injury； as well as examining the H9c2 cardiac muscle cell vigour， cellular morphology， SOD， MDA and other indexes to primarily evaluate and discuss the functional mechanism of intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula. The results show that the intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula has relatively better protection function toward the H9c2 cardiac muscle cell damage induced by H₂O₂ and presents concentration dependency to some extent. The intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula can increase SOD vigour， and decrease MDA emission， thus decreasing the formation of abnormal cell and strengthening the oxidation resistance of cardiac muscle cell. The intestines absorption liquid of Qi benefiting and blood circulation activating formula has protection function to some extent.

[Key words]supplementing Qi and activating blood circulation； myocardial cells； oxidative stress； MDA； SOD

doi：10.4268/cjcmm20162018

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞，或/和冠狀動(dòng)脈痙攣導(dǎo)致心肌缺血缺氧而引起的心臟病，又稱(chēng)缺血性心臟?。↖HD）。中醫(yī)無(wú)“冠心病”病名，根據(jù)其臨床致病特點(diǎn)，在辯證上應(yīng)屬于中醫(yī)學(xué)所指的“胸痹心痛”等范疇。如《素問(wèn)·痹論》有言：“心痹者，脈不通，煩則心下鼓，暴上氣而喘?！痹诠谛牟≈嗅t(yī)診療研究中，冠心病多為本虛標(biāo)實(shí)之癥，因氣虛血瘀、心脈痹阻而發(fā)病。治療上多以益氣、活血及益氣活血之法。張珍玉教授在60余年的臨床實(shí)踐中，總結(jié)出益氣活血是治療冠心病的重要法則，所用經(jīng)驗(yàn)方益氣活血方（人參、黃芪、丹參、川芎）為基本方，臨床隨證加減，該方以益氣養(yǎng)心為主，兼以活血通脈，組方精煉，對(duì)于冠心病患者療效顯著。本課題選取益氣活血方為考察對(duì)象，研究其對(duì)氣虛血瘀型冠心病細(xì)胞層面的防治作用，以期為臨床防治氣虛血瘀型心臟病及后期機(jī)制研究提供參考。

研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血方可有效防治心氣虛型冠心病，通過(guò)提高心肌細(xì)胞抗氧化活力，從而減少心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量，進(jìn)而對(duì)大鼠心肌缺血產(chǎn)生保護(hù)作用^[1]；另有研究表明，心肌缺血性冠心病可產(chǎn)生大量氧自由基^[2]，這也成為誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的主要因素^[3]。因此選用外源性活性氧H₂O₂可使心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，心肌細(xì)胞凋亡模型的建立多選用這種方法^[4-5]。本研究選用體外H₂O₂誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)建立心肌細(xì)胞凋亡模型，對(duì)益氣活血方的作用進(jìn)行考察，同時(shí)選用曲美他嗪作為陽(yáng)性對(duì)照藥^[6]。通過(guò)四甲基偶氮唑鹽（MTT）測(cè)定細(xì)胞存活率，并篩選模型建立的H₂O₂濃度及藥物作用濃度，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD，MDA含量評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞氧化損傷程度，同時(shí)觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)而從體外細(xì)胞效應(yīng)角度對(duì)益氣活血方進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重（230±10） g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證號(hào)SCXK（京）2010-0034。大鼠胚胎心肌細(xì)胞株H9c2購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。

氯化鈉（NaCl），氯化鉀（KCl），碳酸氫鈉（NaHCO₃），磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄），氯化鎂（MgCl₂），氯化鈣（CaCl₂），葡萄糖（C₆H₁₂O₆），二甲基亞砜（DMSO）以上試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM高糖（美國(guó)gibco公司）；雙抗Penicillin-Streptomycin（美國(guó)Thermo 公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胰酶（美國(guó)gibco公司）；曲美他嗪（trimetazidine， TMZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma；H₂O₂溶液（美國(guó)ACROS，10 mol·L^-1）；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma；T-SOD，MDA試劑盒購(gòu)自南京建成。

益氣活血方（由人參、黃芪、丹參、川芎組成）由貴州信邦制藥有限公司提供。

倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；超級(jí)潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾）；CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋）；電子分析天平（德國(guó)Sartorius）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)SpectraMax M5）；臺(tái)式離心機(jī)（上海盧湘儀器）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（天津科諾儀器）；電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器）；組織-器官水浴系統(tǒng)（上海奧爾科特儀器）；循環(huán)水真空泵（鞏義予華儀器）；細(xì)胞超聲粉碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

Tyrode 緩沖鹽溶液配制：NaCl 8.0 g、NaHCO₃1.0 g、KCl 0.28 g、NaH₂PO₄0.05 g、MgCl₂0.1 g溶于500 mL蒸餾水中，4 ℃保存?zhèn)溆茫?CaCl₂0.2 g溶于500 mL蒸餾水中，4 ℃保存?zhèn)溆茫挥脮r(shí)二者混合均勻，加入葡萄糖1.0 g即得^[7]。

2 方法

2.1 益氣活血方供試液的制備

按人參-黃芪-丹參-川芎3∶2∶2∶1稱(chēng)取益氣活血方各飲片，精密稱(chēng)定50 g。以1∶20加入95%乙醇回流提取2 h，自然冷卻，抽濾，得濾液。濾液56 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以每4 g 原生藥材用25 mL Tyrode緩沖鹽溶液，超聲混勻后得益氣活血方供試液，-20 ℃冰箱保存，使用前置于室溫自然解凍。

2.2 益氣活血方腸吸收液制備

依據(jù)本課題組前期研究制備腸吸收液^[8]。充分混勻后于無(wú)菌間的超凈臺(tái)上用0.22 μm無(wú)菌濾膜濾過(guò)除菌，將腸吸收液樣品分裝于無(wú)菌的EP管中，-20 ℃保存待用。

2.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，10%含胎牛血清，0.2%青霉素、鏈霉素雙抗，0.25%胰酶消化傳代，置于37 ℃，5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 H₂O₂損傷心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型制備

消化重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至8×10³個(gè)/L種入96孔板，設(shè)為空白對(duì)照組（無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)孔），其余每孔培養(yǎng)基200 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，每孔加PBS 200 μL洗一遍，第1組加入正常培養(yǎng)基，其余各組加入以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋不同濃度的H₂O₂（50，100，200，400，500，600，700，800 μmol·L^-1）溶液進(jìn)行造模，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后，各孔加入10% MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后，棄去各孔原溶液加DMSO 150 μL，放于搖床上搖動(dòng)10 min，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm下吸光度（A），每組6個(gè)復(fù)孔，取其平均值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（A_正常組-A_{干預(yù)組}）/（A_正常組-A_空白組）×100%。

根據(jù)濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取600 μmol·L^-1H₂O₂溶液進(jìn)行在不同時(shí)間點(diǎn)（15，30，45，60，75，90，105，120 min）的實(shí)驗(yàn)，每組6個(gè)復(fù)孔，取其平均值計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5 篩選益氣活血方腸吸收液作用H9c2細(xì)胞濃度

消化重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至8×10³個(gè)/L種入96孔板，設(shè)空白對(duì)照組（無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)孔），其余每孔培養(yǎng)基200 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，第1組加入正常培養(yǎng)基200 μL，藥物各組加入以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋不同濃度的益氣活血方腸吸收液（0， 7.8， 15.6， 31.3， 62.5， 125， 250， 500 mg·L^-1），陽(yáng)性對(duì)照組加入TMZ（10 μmol），均為200 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入H₂O₂（600 μmol·L^-1 ）溶液對(duì)藥物組及陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行造模，置于培養(yǎng)箱作用1 h后，更換培養(yǎng)液，各孔再加入10% MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后，棄去各孔原溶液加DMSO 150 μL，放于搖床搖動(dòng)10 min，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm下A，每組6個(gè)復(fù)孔，取其平均值計(jì)算細(xì)胞存活率。

根據(jù)益氣活血方腸吸收液濃度篩選結(jié)果，選取最佳作用濃度（15.6，31.3，62.5，125 μmol·L^-1）培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24 h，不進(jìn)行H₂O₂溶液干預(yù)，觀察該濃度下益氣活血方腸吸收液是否對(duì)正常培養(yǎng)細(xì)胞存在損傷。

2.6 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，分為以下幾組，①正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞；②模型組（氧化應(yīng)激組）：心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中添加600 μmol·L^-1 H₂O₂作用1 h；③益氣活血方藥物組：分別以篩選的益氣活血方腸吸收液適宜濃度干預(yù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h后加入600 μmol·L^-1 H₂O₂繼續(xù)作用1 h；④陽(yáng)性對(duì)照組：以曲美他嗪（TMZ）干預(yù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h后再加入600 μmol·L^-1 H₂O₂作用1 h。

2.7 測(cè)定不同給藥組中MDA，T-SOD活性

在H9c2細(xì)胞給藥培養(yǎng)24 h，H₂O₂溶液作用1 h后，取細(xì)胞，消化，離心，置于細(xì)胞超聲粉碎儀粉碎細(xì)胞，吸取細(xì)胞粉碎勻漿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA，SOD。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 H₂O₂作用濃度及作用時(shí)間

在不同濃度H₂O₂（50，100，200，400，500，600，700，800 μmol·L^-1）溶液作用H9c2細(xì)胞1 h后，隨著H₂O₂濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸減弱，且在高濃度H₂O₂（700，800 μmol·L^-1）作用于細(xì)胞時(shí)，心肌細(xì)胞存活率與H₂O₂濃度不成線性關(guān)系^[9]。在600 μmol·L^-1 H₂O₂溶液作用不同時(shí)間（15，30，45，60，75，90，105，120 min）后，發(fā)現(xiàn)H9c2細(xì)胞在此濃度下存在著時(shí)間依賴性，隨著作用時(shí)間增加，細(xì)胞存活逐漸降低。根據(jù)濃度、時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在600 μmol·L^-1H₂O₂溶液作用1 h的條件下，濃度摸索實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞存活率為54.28%±4.10%（圖1A），時(shí)間摸索實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞存活率為56.26%±3.68%（圖1B），故選取此條件進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

3.2 益氣活血方腸吸收液濃度篩選

隨著益氣活血方腸吸收液質(zhì)量濃度（0， 7.8， 15.6， 31.3， 62.5，125 mg·L^-1）的增加，細(xì)胞活力增強(qiáng)，在“量-效”關(guān)系上存在一定的劑量依賴性；在低質(zhì)量濃度（7.8 mg·L^-1）時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活力作用不明顯，說(shuō)明低濃度的益氣活血方腸吸收液對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有明顯作用；在高質(zhì)量濃度（250， 500 mg·L^-1）時(shí)，細(xì)胞活力減弱，說(shuō)明在高濃度的益氣活血方腸吸收液存在一定的細(xì)胞毒性（圖2a）。而在15.63， 31.25， 62.50， 125 mg·L^-1孵育正常H9c2時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞毒性，且具有一定增強(qiáng)細(xì)胞活力的作用（圖2b）。故選擇質(zhì)量濃度為15.63， 31.25， 62.50， 125 mg·L^-1的益氣活血方腸吸收液進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)研究。

3.3 益氣活血方腸吸收液對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的氧化損傷作用

與正常組比較，模型組細(xì)胞存活率為49.0%；與模型組比較，藥物組細(xì)胞存活率明顯提高，說(shuō)明益氣活血方對(duì)H9c2細(xì)胞在H₂O₂誘導(dǎo)氧化應(yīng)激中具有一定的保護(hù)作用；在益氣活血方作用于無(wú)H₂O₂誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞時(shí)，藥物處理組細(xì)胞存活率高于正常組，顯示益氣活血方對(duì)H9c2細(xì)胞也具有一定增殖作用。在益氣活血方質(zhì)量濃度為125 mg·L^-1時(shí)，細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力最明顯，存活率最高（圖2）。

3.4 H9c2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

3.4.1 H₂O₂誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷 將H₂O₂（50，100，200，400，500，600，700，800 μmol·L^-1）溶液加入到心肌細(xì)胞中作用1 h后，置于倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。正常H9c2細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，H₂O₂誘導(dǎo)后則表現(xiàn)出一種獨(dú)特的形態(tài)變化，與正常心肌細(xì)胞相比較，可觀察到在H₂O₂的氧化損傷下，心肌細(xì)胞收縮，形狀不規(guī)則，細(xì)胞間差距變大，懸浮細(xì)胞增加等現(xiàn)象；在H₂O₂ 600 μmol·L^-1組，心肌細(xì)胞皺縮明顯，在700，800 μmol·L^-1組，a.加入不同濃度益氣活血方腸吸收液（0， 7.8， 15.6， 31.3， 62.5， 125， 250，500 mg·L^-1）培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24 h，再加入600 μmol·L^-1 H₂O₂作用1 h；b.加入不同濃度益氣活血方腸吸收液（15.63， 31.25， 62.50，125 mg·L^-1）培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24 h。與正常對(duì)照組組相比**P<0.01，*P<0.05；與模型組相比##P<0.01，#P<0.05。

心肌細(xì)胞現(xiàn)大量皺縮現(xiàn)象，懸浮細(xì)胞增加。

3.4.2 益氣活血方對(duì)H9c2細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 H9c2細(xì)胞經(jīng)過(guò)益氣活血方（15.63， 31.25， 62.50， 125 mg·L^-1）和H₂O₂（600 μmol·L^-1）處理1 h后，與H₂O₂模型組相對(duì)比，可觀察到隨著益氣活血方濃度的增加細(xì)胞收縮減輕，形狀不規(guī)則、懸浮細(xì)胞等異常細(xì)胞的比例逐漸減少（圖3）。

3.5 益氣活血方對(duì)氧化損傷心肌細(xì)胞SOD，MDA活性影響

H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可使心肌細(xì)胞產(chǎn)生一系列病理變化，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA，T-SOD的變化來(lái)確定益氣活血方是否影響與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的氧化酶與抗氧化酶的活性。與正常組比較，模型組細(xì)胞中MDA水平顯著升高（P<0.01）；與模型組相比較，各給藥組（31.25，62.50，125 mg·L^-1）細(xì)胞中MDA水平顯著降低（P<0.05）（圖4）。與正常組比較，模型組細(xì)胞中T-SOD活性顯著降低（P<0.01）；與模型組相比較，各給藥組（15.63，31.25，62.50，125 mg·L^-1）細(xì)胞中T-SOD活性水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）（圖4）。以上結(jié)果表明，藥物組隨藥物濃度增加，T-SOD酶活力增強(qiáng)，而MDA水平降低，通過(guò)上調(diào)T-SOD，下調(diào)MDA 途徑來(lái)抑制H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷；在藥物質(zhì)量濃度為125 mg·L^-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDA，T-SOD水平與TMZ組較接近，這也說(shuō)明益氣活血方在心肌細(xì)胞抗氧化能力方面與TMZ相似。

4 討論

氧化應(yīng)激是指由于機(jī)體氧自由基過(guò)量或清除自由基能力減弱，導(dǎo)致氧自由基的增多，進(jìn)而對(duì)機(jī)體造成多種毒性作用的病理狀態(tài)^[10]。因H₂O₂是一種重要且又易于獲得的活性氧，具有相對(duì)穩(wěn)定的性質(zhì)?，F(xiàn)代研究表明，高濃度（>1 mmol·L^-1）H₂O₂易使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，造成細(xì)胞壞死，而低濃度H₂O₂可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡基因表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡^[11]，故在實(shí)驗(yàn)中需對(duì)H₂O₂濃度進(jìn)行摸索，確定H₂O₂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳作用濃度。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷在心肌缺血再灌注損傷及心力衰竭等疾病中有著重要作用^[12-14]。在心血管疾病從分子細(xì)胞水平進(jìn)行有效藥物篩選及發(fā)病機(jī)制研究中，H9c2心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)研究模型已成為主要方法之一^[15]。

益氣活血方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要治療氣虛血瘀型心臟病，臨床療效確切，方中藥物藥理作用在現(xiàn)代有較多研究，人參Panax ginseng C. A. Mey. 在中醫(yī)診療中廣泛應(yīng)用，其主要活性物質(zhì)是人參皂苷，主要包括Rb₁，Rb₂，Rc，Rg₁等，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb₁可有效抑制H₂O₂引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的升高^[16]，降低LDH漏出量，改善細(xì)胞活力，抑制線粒體膜電位降低，降低細(xì)胞凋亡水平^[17]；人參皂苷Re在急性心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中具有一定保護(hù)作用^[18]；人參皂苷Rg₁在缺氧-復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞中可有效提高細(xì)胞活力^[19-20]；人參皂苷Rg₂在體外低氧損傷心肌細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞凋亡，提高抗氧化酶活力及清除自由基的作用^[21]。黃芪中含有多種活性物質(zhì)，黃芪甲苷是其主要藥理活性物質(zhì)之一，研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷對(duì)缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用，可有效降低MDA含量，提高SOD含量，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用^[22]；黃芪皂苷Ⅳ通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抗H₂O₂誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化損傷，顯著提高細(xì)胞存活率，減輕細(xì)胞凋亡^[23]。丹參中丹參酮Ⅱ_A可有效抑制H₂O₂誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，顯著降低心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）活性及MDA含量，并可增加總抗氧化能力（T-AOC）、SOD活力，進(jìn)而對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用^[24-25]。川芎中川芎內(nèi)酯A在體外缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞中，可減少LDH漏出率，降低MDA含量，提高SOD活性，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用^[26]。

本研究通過(guò)培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，以外源性H₂O₂誘導(dǎo)建立細(xì)胞凋亡模型，首先對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模型作用條件及益氣活血方作用濃度進(jìn)行摸索研究，確定作用條件為H₂O₂濃度600 μmol·L^-1，作用時(shí)間1 h，確定益氣活血方作用質(zhì)量濃度為15.6，31.3，62.5，125 mg·L^-1。因活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢，而死細(xì)胞無(wú)此功能^[27]，而MDA具有細(xì)胞毒性作用，可與蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)， 誘發(fā)細(xì)胞凋亡，在金屬離子存在下SOD活性下降可引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化物催化裂解產(chǎn)生MDA^[28]。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞內(nèi)MDA水平及T-SOD活性來(lái)評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞氧化損傷狀態(tài)，并以此評(píng)定益氣活血方對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.01），細(xì)胞形態(tài)明顯改變，MDA水平顯著增加（P<0.01），而T-SOD活力顯著減弱（P<0.01），而在加入各濃度益氣活血方預(yù)處理后，與模型組相比細(xì)胞存活率、T-SOD活力呈濃度依賴性顯著升高（P<0.05或P<0.01），細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面得到改善，細(xì)胞內(nèi)MDA水平呈濃度依賴性變化減弱（P<0.05或P<0.01），說(shuō)明益氣活血方對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有顯著的保護(hù)作用，且有一定的增加心肌細(xì)胞抗氧化的能力。在作用機(jī)制方面，益氣活血方可能通過(guò)提高細(xì)胞SOD活性，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體自身清除氧自由基的能力，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高H9c2心肌細(xì)胞存活率，從而發(fā)揮對(duì)缺血損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。在相關(guān)機(jī)制方面，諸多研究表明，ERK1/2及PI3K信號(hào)通路在H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用^[29-30]，而益氣活血方是否與此通路相關(guān)還有待驗(yàn)證；益氣活血方是否通過(guò)其他機(jī)制對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，及其具體作用機(jī)制方面還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

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[責(zé)任編輯 馬超一]