基于氫核磁共振技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法鑒別蜂蜜品種

宋曉瑩，陳蘭珍,2,3*，李 熠,2,3，周金慧,2,3，陳 雷，辛曼曼

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蜜蜂研究所，北京 100093；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,北京 100093；4.中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所，湖北 武漢 430071)

蜂蜜的物質(zhì)組成復(fù)雜，其主要成分是糖類(lèi)，占蜂蜜成分的65%～80%，糖類(lèi)中又以葡萄糖和果糖為主。此外，還有18%～22%的水，少量的蛋白質(zhì)、酶、游離氨基酸、黃酮類(lèi)物質(zhì)、酚酸類(lèi)物質(zhì)、礦物元素以及微量元素[1]。常見(jiàn)的蜂蜜品種是按照蜜蜂所采集的蜜源植物不同進(jìn)行劃分。我國(guó)地域遼闊，蜜源植物種類(lèi)較多，能得到的商品蜜種類(lèi)多達(dá)幾十種。因此，還衍生出其他劃分蜂蜜品種的方式，如根據(jù)蜂蜜的顏色可劃分為淺色蜜和深色蜜，市面上常見(jiàn)的洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜、椴樹(shù)蜜為淺色蜜，棗花蜜、蕎麥蜜為深色蜜。

蜂蜜作為一種藥食同源的食品，近年來(lái)的市場(chǎng)需求量不斷增加。由于不同蜜源植物來(lái)源的蜂蜜品質(zhì)及感官特征不同[2]，因此在市場(chǎng)中，不同品種蜂蜜的價(jià)格差異較大，且以淺色蜜更受歡迎[3]。但不同種蜂蜜的主要成分含量差別很小，傳統(tǒng)方法很難鑒別蜂蜜品種，因此出現(xiàn)了低價(jià)蜜摻入高價(jià)蜜中進(jìn)行銷(xiāo)售的現(xiàn)象，造成蜂蜜品種標(biāo)識(shí)混淆，市場(chǎng)價(jià)格混亂[4]，并已成為蜂蜜市場(chǎng)中一個(gè)比較突出的問(wèn)題。

蜂蜜品種的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是感官鑒別和花粉分析，其結(jié)果判斷帶有一定的主觀性，需要實(shí)驗(yàn)員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)和專(zhuān)業(yè)的知識(shí)背景[5-6]。近年，一些檢測(cè)技術(shù)也被應(yīng)用于蜂蜜品種鑒別中，主要包括高效液相色譜[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[9]、光譜技術(shù)(如近紅外光譜、中紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜)[10-13]、電感耦合等離子體質(zhì)譜[14]等。這些方法均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，尚未有一種檢測(cè)技術(shù)能夠有效地鑒別不同品種的蜂蜜。

氫核磁共振技術(shù)(1H NMR)是依靠核磁共振現(xiàn)象測(cè)定分子結(jié)構(gòu)的一種譜學(xué)技術(shù)，通過(guò)對(duì)樣本施加外加磁場(chǎng)，使處在低能態(tài)的自旋核發(fā)生躍遷到高能態(tài)，當(dāng)自旋核發(fā)生弛豫返回低能態(tài)時(shí)，產(chǎn)生核磁共振信號(hào)[15]。該技術(shù)一次進(jìn)樣就可檢出樣品中所有含氫的化合物，檢測(cè)物質(zhì)的覆蓋面廣，樣本預(yù)處理簡(jiǎn)單，上機(jī)分析所需時(shí)間較短。近年來(lái)，1H NMR被廣泛應(yīng)用到食品領(lǐng)域，并在牛奶[16]、橄欖油[17]、酒類(lèi)[18]的品種鑒別以及咖啡[19]、牛奶[20]的產(chǎn)地識(shí)別中取得了很好的成果。現(xiàn)階段，該方法在蜂蜜品種鑒別領(lǐng)域中的應(yīng)用較少。本研究采用1H NMR對(duì)洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜進(jìn)行全譜圖分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法，以期從整體物質(zhì)角度，建立最佳的判別分析模型，從而為解決蜂蜜品種的鑒別提供行之有效的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AVANCE 600MHz液體NMR儀(瑞士 Bruker 公司)；PL103電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)：移液槍(德國(guó) Eppendorf 公司)；1-15PK臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó) Sigma 公司)；5 mm 核磁管(美國(guó) Norell 公司)；渦旋混合器(美國(guó) Scientific Industries 公司)。

三水合磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；重水(D2O，99.9%氘代，含0.05 g/100 mL 2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸(TSP)，美國(guó) Cambridge Isotope Laboratories公司)。

1.2 樣品信息

實(shí)驗(yàn)選擇的蜂蜜品種為洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜，均為較受市場(chǎng)歡迎的淺色蜜。所有的蜂蜜樣品均直接取自蜂場(chǎng)中自然釀造的成熟蜜。共收集144個(gè)樣品，在4 ℃的冰箱中貯藏、備用。蜂蜜樣本的具體信息如表1所示。

表1 蜂蜜樣本的信息Table 1 The information of honey samples

1.3 NMR樣品的制備

將蜂蜜從冰箱中取出，放置至室溫。對(duì)有結(jié)晶的樣品，在60 ℃水浴加熱，待樣品完全溶解后再稱(chēng)樣。稱(chēng)取蜂蜜100.00 mg置于離心管中，加入1.2 mL pH 7.4的磷酸緩沖液(0.15 mol/L K2HPO4/ NaH2PO4,使用含10% D2O 的雙蒸水配制而成)后，在渦旋振蕩器上振蕩5 min，直至樣品混合均勻。在8 000 r/min下離心10 min,取600 μL上清液轉(zhuǎn)至5 mm 核磁管中。

1.4 數(shù)據(jù)采集與處理

在600 MHz液體NMR儀上，采用NOESYPR1D脈沖序列(Recycle delay-90°-t1-90°-tm-90°-acquisition)采集樣品信息，序列中90°脈沖的脈寬為14.5 μs，固定間隔t1為4 μs，混合時(shí)間tm為2.27 s，實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置為298 K。采用預(yù)飽和方法進(jìn)行水峰抑制，持續(xù)2.0 s。1H NMR的譜寬設(shè)為 12 000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)為32 768，信號(hào)累加次數(shù)為64次。所有得到的自由感應(yīng)衰減信號(hào)經(jīng)過(guò)指數(shù)加權(quán)和傅里葉變化(指數(shù)線(xiàn)寬因子為0.3 Hz)后得到核磁共振的一維圖譜。

對(duì)得到的1H NMR譜圖進(jìn)行處理，手動(dòng)調(diào)節(jié)基線(xiàn)、相位，對(duì)化學(xué)位移定標(biāo),將內(nèi)標(biāo)TSP的共振峰設(shè)為δ0.00。將處理好的NMR譜圖按照每段寬度為δ0.004進(jìn)行分段積分，為消除殘留水信號(hào)的影響，剔除δ4.73～4.93區(qū)間的信號(hào)。為減少不同組分和樣品間的差異，對(duì)信號(hào)峰的峰面積進(jìn)行歸一化處理，所得到的積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入Excel文件中保存。采用SIMCA 13.0 軟件(v13.0,Umetrics.,Sweden)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖1 洋槐蜜(A)、油菜蜜(R)、荔枝蜜(L)的1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectra of acacia honey(A),rape honey(R) and lychee honey(L)1.formic acid(甲酸),2.phenylalanine(苯丙氨酸), 3.tyrosine(酪氨酸),4.kojibiose(曲二糖), 5.sucrose(蔗糖),6.nigerose(黑曲霉糖), 7.turanose(松二糖),8.α-glucose(α-葡萄糖),9.citric acid(檸檬酸),10.succinic acid(琥珀酸),11.proline(脯氨酸), 12.acetic acid(乙酸),13.alanine(丙氨酸),14.lactic acid(乳酸), 15.3-hydroxy-butanone(3-羥基丁酮),16.ethyl acetate(乙酸乙酯), 17.ethanol(乙醇),18.2,3-bu-tandiol(2,3-丁二醇), 19.valine(纈氨酸)

2 結(jié)果與討論

2.1 譜圖解析

選取洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜的核磁譜圖進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)不同品種蜂蜜的譜圖無(wú)明顯差異。蜂蜜的1H NMR 譜圖可以分為3部分：脂肪區(qū)(δ0.0～3.0)，糖類(lèi)化合物區(qū)(δ3.0～6.0)，芳香區(qū)(δ6.0～9.5)。通過(guò)局部放大3個(gè)區(qū)域的主要信號(hào)峰區(qū)間(圖1)，對(duì)其中的信號(hào)峰進(jìn)行鑒別，并結(jié)合化學(xué)位移、耦合常數(shù)、峰形等信息，查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)對(duì)信號(hào)峰進(jìn)行歸屬后，共鑒定出19種化合物[21-23]。

在脂肪區(qū)主要集中有機(jī)酸、氨基酸以及醇類(lèi)物質(zhì)的信號(hào)峰。在糖類(lèi)化合物區(qū)域，有效信號(hào)主要集中在δ5.0～5.5，集中著單糖和二糖信號(hào)。在芳香區(qū)中，可鑒別出苯丙氨酸、酪氨酸、甲酸3種物質(zhì)中苯環(huán)上氫質(zhì)子的共振信號(hào)。

2.2 數(shù)據(jù)分析

在蜂蜜中,葡萄糖、果糖等單糖含量較高，與丙氨酸等含量低的物質(zhì)在含量上可以相差數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，因此在后續(xù)進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，信號(hào)較弱的成分含量變化會(huì)被信號(hào)較強(qiáng)的成分含量變化所掩蓋，進(jìn)而影響差異成分的識(shí)別。為了避免上述情況出現(xiàn)，在建模前需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。常見(jiàn)的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法包括：中心化(Mean center scaling,Ctr)、自標(biāo)度化(Unit variance scaling,UV)、帕萊托標(biāo)準(zhǔn)化(Pareto scaling,Par)。Ctr 處理是將數(shù)據(jù)集中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)減去其均值，既不會(huì)改變樣本點(diǎn)之間的相對(duì)位置，也不會(huì)促使變量間相關(guān)性發(fā)生改變，能夠更好地分析數(shù)據(jù)集中波動(dòng)的部分，但可能導(dǎo)致低含量的變量信息受到高含量變量信息的抑制[24]。UV處理可使新得到的每個(gè)變量的均值或標(biāo)準(zhǔn)差在同一個(gè)等級(jí)上，但噪聲信號(hào)區(qū)域可能會(huì)影響最終結(jié)果[25]。在Par處理中，中心化和尺度變化同時(shí)進(jìn)行,通過(guò)對(duì)每個(gè)變量賦予相同的縮放系數(shù)，可有效地減少較大信號(hào)數(shù)據(jù)的相對(duì)重要性，保留原始數(shù)據(jù)集結(jié)構(gòu)的完整性，但變化相對(duì)較小的重要變量無(wú)法被選定為標(biāo)記物[26]。因此，3種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際分析中需根據(jù)具體的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。

在SMICA軟件中，常見(jiàn)的評(píng)價(jià)模型質(zhì)量的參數(shù)有R2X、R2Y和Q2，其中R2X、R2Y分別代表模型對(duì)數(shù)據(jù)矩陣的解釋能力，Q2代表模型整體的預(yù)測(cè)能力。通常情況下，R2和Q2值越接近1，則說(shuō)明模越穩(wěn)定可靠，該值大于0.5就證明模型的判別效果較好。

表2 PLS-DA模型在不同數(shù)據(jù)預(yù)處理下的模型參數(shù)Table 2 Model parameters of PLS-DA model under different data scaling methods

圖2 PLS-DA在UV預(yù)處理下的得分散點(diǎn)圖Fig.2 Score scatter plot of PLS-DA with UV scaling

MethodR2X(cum)R2Y(cum)Q2(cum)Ctr0.7690.5260.471UV0.6320.9580.905Par0.6850.6940.607

圖3 OPLS-DA在UV預(yù)處理下的得分散點(diǎn)圖Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA with UV scaling

2.2.1偏最小二乘判別分析偏最小二乘判別分析(PLS-DA)是一種常見(jiàn)的有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，是在主成分分析的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)隱形變量(Y)，使自變量向Y回歸的程度達(dá)到最大，以此弱化組內(nèi)之間的差異，突出組間的差異[27]。

分別在3種預(yù)處理?xiàng)l件下建立PLS-DA模型，3個(gè)模型中的參數(shù)見(jiàn)表2。通過(guò)參數(shù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在UV模式下模型的判別效果最好。在此條件下建立PLS-DA模型，該模型中前8個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率R2Y已近95%，超過(guò)一般要求的累積貢獻(xiàn)率(85%)。根據(jù)模型的得分散點(diǎn)圖(圖2)可看出，荔枝蜜樣本主要集中在PC1得分值的負(fù)值區(qū)域，而洋槐蜜、油菜蜜樣本主要集中在PC1得分值的正值區(qū)域；油菜蜜樣本主要集中在PC2得分值的正值區(qū)域，洋槐蜜樣本主要集中在PC2得分值的負(fù)值區(qū)域。3種蜂蜜之間有著明顯的分離趨勢(shì)，但仍然存在過(guò)重合的現(xiàn)象，需選擇更為合適的判別模型。

2.2.2正交偏最小二乘判別分析為了進(jìn)一步去除不相關(guān)的差異，更好地進(jìn)行判別分離，在PLS-DA 基礎(chǔ)上結(jié)合正交信號(hào)，去除與Y矩陣無(wú)關(guān)的X矩陣的變化，使得X矩陣和Y矩陣之間的關(guān)系最大化，將分組差異最大化[28]。因此，采用正交偏最小二乘判別法(OPLS-DA法)進(jìn)一步分析、比較不同品種蜂蜜之間的差異。

分別在3種預(yù)處理?xiàng)l件下建立OPLS-DA模型，通過(guò)對(duì)比同模型的特征參數(shù)值(表3)，發(fā)現(xiàn)在UV模式下，模型的R2Y和Q2值均最高，因此選擇UV作為建模時(shí)的數(shù)據(jù)預(yù)處理方式。根據(jù)OPLS-DA模型得分圖(圖3)，發(fā)現(xiàn)在第二主成分下，3種蜂蜜可以得到很好的判別分離，油菜蜜主要集中在PC2得分值的正值區(qū)域，荔枝蜜處在坐標(biāo)的中心區(qū)域，而洋槐蜜主要分布在PC2得分值的負(fù)值區(qū)域。

利用OPLS-DA模型可以有效地區(qū)分洋槐蜜、油菜蜜和荔枝蜜，所建模型對(duì)3種蜂蜜的判別解釋能力達(dá)95.8%，對(duì)未知樣本的預(yù)測(cè)能力為90.5%。

3 結(jié) 論

本文采用1H NMR結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法進(jìn)行蜂蜜品種的鑒別。通過(guò)對(duì)不同品種蜂蜜的主要核磁信號(hào)峰進(jìn)行歸屬，共鑒定出19種化合物的特征峰。為了更好地挖掘核磁數(shù)據(jù)中的信息，討論了在建立判別模型中數(shù)據(jù)預(yù)處理的方法，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)自標(biāo)度化為最適合核磁數(shù)據(jù)建模的數(shù)據(jù)預(yù)處理方式。通過(guò)不斷篩選合適的數(shù)據(jù)分析模型，發(fā)現(xiàn)在自標(biāo)度化處理下，利用OPLS-DA模型可以很好地區(qū)分洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜。本文所采用的1H NMR是基于蜂蜜的全組分分析方法，能夠獲得樣品的全部有效信息，有效彌補(bǔ)了其他檢測(cè)技術(shù)對(duì)檢出物質(zhì)化學(xué)鍵、官能團(tuán)的限制。將1H NMR與OPLS-DA相結(jié)合，能夠快速、準(zhǔn)確地區(qū)分不同品種的蜂蜜，從而為規(guī)范蜂蜜市場(chǎng)提供了一種新方法。