固相支撐液液萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定尿液中7種多環(huán)芳烴代謝物

陳雪蕾，李冬梅，徐厚君，王學(xué)生，王曼曼*

(1.華北理工大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063210；2.華北理工大學(xué) 藥學(xué)院，河北 唐山 063210)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一類分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的碳?xì)浠衔?，是典型的持久性有機(jī)污染物[1]。PAHs種類多、分布廣，具有“三致”毒性，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)確認(rèn)為第一組致癌物質(zhì)[2-3]。PAHs廣泛分布于污染的空氣、水體、土壤、食物和煙草煙霧等介質(zhì)中，相對(duì)于一般環(huán)境，PAHs暴露接觸濃度和暴露劑量在職業(yè)環(huán)境中尤為突出[4-5]。PAHs可經(jīng)呼吸道、消化道和皮膚等多種途徑進(jìn)入機(jī)體，對(duì)人體健康造成有害影響，有研究表明PAHs暴露與肺癌、膀胱癌和女性乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生有關(guān)[3,6-7]，因此獲得準(zhǔn)確PAHs暴露水平是進(jìn)行PAHs健康評(píng)價(jià)以及安全控制的前提。

進(jìn)入人體內(nèi)的PAHs經(jīng)肝臟代謝并轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)的羥基多環(huán)芳烴(Hydroxyl polycyclic aromatic hydrocarbons，OH-PAHs)，隨后經(jīng)尿液或糞便排出體外[8]?？紤]到PAHs暴露途徑多樣化，同時(shí)尿液樣品無(wú)創(chuàng)、易得，尿液中的OH-PAHs被廣泛用作生物標(biāo)志物以綜合全面評(píng)價(jià)PAHs在人體暴露水平[9]。芘的代謝物1-羥基芘是最常用的PAHs職業(yè)接觸生物標(biāo)志物，Shen等[10]將焦?fàn)t工人尿液中1-羥基芘作為PAHs內(nèi)暴露標(biāo)志物，評(píng)估了機(jī)體長(zhǎng)期暴露于PAHs對(duì)炎癥反應(yīng)和肺功能的影響；Bal等[11]通過(guò)尿液中1-羥基芘含量來(lái)評(píng)估瀝青道路鋪設(shè)工人暴露于PAHs對(duì)DNA氧化損傷的影響。但越來(lái)越多的研究顯示，聯(lián)合尿液中多種OH-PAHs能夠更全面評(píng)估人體暴露于PAHs的水平[12-14]。因此，建立簡(jiǎn)單、快速測(cè)定尿液中多種OH-PAHs的方法對(duì)于PAHs暴露健康評(píng)價(jià)具有重要意義。

尿液中OH-PAHs的分析測(cè)定包括樣品前處理以及儀器分析兩個(gè)環(huán)節(jié)，其中儀器分析包括液相色譜-熒光法(HPLC-FLD)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[15-18]。由于尿液中待測(cè)物含量低，不易檢出，且尿液成分復(fù)雜，干擾測(cè)定，因此尿液樣品前處理成為儀器分析之前重要且關(guān)鍵的步驟。目前，測(cè)定尿液中OH-PAHs常用的前處理方法主要包括液液萃取法(Liquid-liquid extraction，LLE)[19]和固相萃取法(Solid-phase extraction，SPE)[12,20-21]。

固相支撐液液萃取法(Solid supported liquid-liquid extraction，SLE)是在傳統(tǒng)液液萃取法的基礎(chǔ)上，采用硅藻土作為吸附劑，利用其結(jié)構(gòu)多孔、吸水性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，從而在互不相溶的兩相實(shí)現(xiàn)快速微觀液液萃取的一種新型前處理方法[22-23]。與LLE相比，多孔的硅藻土表面能夠形成一層薄薄的液膜，提供了大的比表面積，從而提高了萃取效率；而與SPE相比，SLE避免了活化和淋洗步驟，操作簡(jiǎn)化，且具有不易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象的優(yōu)點(diǎn)。目前，SLE已成功應(yīng)用于食品、生物和環(huán)境等領(lǐng)域的樣品前處理。Seo等[24]采用SLE結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了同時(shí)測(cè)定蘋果果汁、玉米等食品中7種N-亞硝胺的分析方法；Gao等[25]利用SLE結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定了血液中的雙甲脒及其代謝物；Wang等[26]建立了基于SLE結(jié)合氣相色譜法測(cè)定淡水魚及水體中共平面多氯聯(lián)苯的方法。

本研究將固相支撐液液萃取法用于尿液中OH-PAHs的前處理，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了簡(jiǎn)單、快速同時(shí)測(cè)定尿液中7種OH-PAHs的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LCMS-8060超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)；ET-3001氮吹濃縮儀(北京歐陸科儀進(jìn)口儀器有限公司)；KQ-700GVDV型雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；ISOLUTE?SLE+(1 mL)固相支撐液液萃取柱(北京綠綿科技有限公司)。

1-羥基萘(1-Hydroxy-naphthalene,1-OHNap)、2-羥基萘(2-Hydroxy-naphthalene,2-OHNap)、2-羥基芴(2-Hydroxy-fluorene,2-OHFlu)和9-羥基芴(9-Hydroxy-fluorene,9-OHFlu)(純度≥98.0%，北京Dikma科技有限公司)；2-羥基菲(2-Hydroxy-phenanthrene,2-OHPhe)、9-羥基菲(9-Hydroxy-phenanthrene,9-OHPhe)、2-羥基萘-D7(2-Hydroxy-naphthalene-D7,2-OHNap-D7)、2-羥基芴-D9(2-Hydroxy-fluorene-D9,2-OHFlu-D9)、1-羥基菲-D9(1-Hydroxy-phenanthrene-D9,1-OHPhe-D9)、1-羥基芘(1-Hydroxy-pyrene,1-OHPyr)、1-羥基芘-D9(1-Hydroxy-pyrene-D9,1-OHPyr-D9)(≥98.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)；β-葡萄糖醛酸酶-芳基硫酸酯酶水溶液(Type HP-2，≥100 000 unites/mL，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；甲基叔丁基醚、正己烷(色譜純，北京迪科馬科技有限公司)；石油醚、乙酸(分析純，上海阿拉丁試劑公司)；無(wú)水乙酸鈉(≥99%，天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

OH-PAHs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用甲醇配制濃度為1.0 g·L-1的上述7種OH-PAHs(2-OHNap、1-OHNap、9-OHFlu、2-OHFlu、2-OHPhe、9-OHPhe、1-OHPyr)以及4種同位素內(nèi)標(biāo)物(2-OHNap-D7、2-OHFlu-D9、1-OHPhe-D9、1-OHPyr-D9)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃避光保存。使用時(shí)，分別準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使用甲醇稀釋成濃度為10.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品的采集與制備

采集連續(xù)工作5天的河北省某企業(yè)無(wú)吸煙史的石油工人晨尿，于-80 ℃存儲(chǔ)。使用時(shí)，將尿液樣品自然解凍至室溫，混合均勻，準(zhǔn)確量取5 mL于15 mL具塞離心管中，加入10 μLβ-葡萄糖醛酸酶-芳基硫酸酯酶混合水解酶液和20 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液后，再加入5 mL 0.5 mol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)。將以上混合液置于恒溫振蕩水槽中，37 ℃避光水解4 h后，于1 500 r·min-1離心10 min，取上清液于4 ℃儲(chǔ)存待用。另采集在校大學(xué)生晨尿，處理方法同上，作為非職業(yè)暴露人群對(duì)照樣品。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 SLE流程

準(zhǔn)確量取0.8 mL尿液樣品酶解液上樣至SLE萃取小柱，靜置5 min，使樣品完全吸附在支撐材料表面，隨后加入6 mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并氮吹至干后，用甲醇定容至200 μL并經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。整個(gè)萃取過(guò)程需10 min。

1.5 UPLC-MS/MS分析條件

色譜柱為XR-ODS柱(100 mm×2.0 mm I.D.，2.2 μm，日本島津公司)，流動(dòng)相為乙腈和水，采用梯度程序洗脫，20 min內(nèi)乙腈的比例從5%線性增長(zhǎng)至100%。流速為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫26 ℃。

采用電噴霧電離(ESI)源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)采集，負(fù)離子(-)模式檢測(cè)，霧化氣流量為3 L·min-1，干燥氣流量10 L·min-1，加熱氣流量10 L·min-1，接口溫度300 ℃，脫溶劑溫度300 ℃，加熱塊溫度400 ℃，碰撞誘導(dǎo)解離氣體230 kPa。7種OH-PAHs以及4種同位素內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間、母離子、子離子等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 7種OH-PAHs及4種同位素內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of seven OH-PAHs and four isotope internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 固相支撐液液萃取條件的建立

OH-PAHs是一類極性化合物，常使用C18作為吸附劑的固相萃取法進(jìn)行樣品前處理。固相支撐液液萃取能夠用于水相體系中極性化合物的有效前處理，不同于傳統(tǒng)的固相萃取法，固相支撐液液萃取過(guò)程僅有上樣和洗脫兩個(gè)步驟，其中洗脫步驟是影響方法準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素，因此實(shí)驗(yàn)考察了洗脫溶劑種類和體積對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

圖1 洗脫溶劑種類對(duì)7種OH-PAHs回收率的影響(n=3)Fig.1 Effect of eluting solvent type on recoveries of seven OH-PAHs(n=3)

圖2 氮吹濃縮壓力對(duì)7種OH-PAHs回收率的影響Fig.2 Effect of nitrogen evaporation pressure on recoveries of seven OH-PAHs

在對(duì)照尿液基質(zhì)樣品中加入7種OH-PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平均為5 mg·L-1，固定上樣體積為0.8 mL，洗脫體積為6 mL，分別以甲基叔丁基醚、石油醚、正己烷和乙酸乙酯4種有機(jī)溶劑作為洗脫溶劑對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行洗脫(n=3)，結(jié)果如圖1所示。乙酸乙酯對(duì)目標(biāo)物的洗脫效果最佳，7種OH-PAHs的回收率均能達(dá)到90%以上，特別是對(duì)苯環(huán)數(shù)為2的2-OHNap和1-OHNap，平均回收率為96.6%～103%，說(shuō)明SLE對(duì)所選目標(biāo)物具有良好的萃取能力。為了節(jié)約溶劑，同時(shí)避免由于洗脫溶劑過(guò)多而引起的誤差，實(shí)驗(yàn)對(duì)洗脫溶劑體積分別為5、6、7 mL時(shí)進(jìn)行考察(n=3)。結(jié)果表明，當(dāng)乙酸乙酯的體積由5 mL增至6 mL時(shí)，7種OH-PAHs的回收率增加；進(jìn)一步增加洗脫體積，回收率降低，這是由于洗脫溶劑體積的增加延長(zhǎng)了氮吹濃縮時(shí)間，造成了目標(biāo)物損失。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇6 mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫。對(duì)尿液樣品的整個(gè)SLE前處理過(guò)程僅需10 min，操作簡(jiǎn)單、快速、省時(shí)。

2.2 氮吹濃縮條件的建立

氮吹濃縮是樣品前處理過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)，也是影響目標(biāo)物回收率的重要參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中，2-OHNap和1-OHNap易揮發(fā)，因此固定氮吹溫度為25 ℃，對(duì)氮吹濃縮壓力在20～55 kPa范圍內(nèi)進(jìn)行了考察。上樣體積為0.8 mL，使用6 mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，對(duì)7種OH-PAHs加標(biāo)濃度均為5 mg·L-1的尿液樣品平行測(cè)定3次，由圖2可知，隨著氮吹壓力的升高，目標(biāo)物的回收率也隨之增高，當(dāng)?shù)祲毫_(dá)到34 kPa，繼續(xù)增大氮吹壓力時(shí)，各化合物的回收率變化不大。然而，當(dāng)?shù)祲毫_(dá)到55 kPa時(shí)，回收率降低。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇最佳氮吹壓力為48 kPa。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1線性范圍、檢出限與定量下限在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，配制一系列含7種不同濃度的OH-PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中均含3mg·L-1的同位素內(nèi)標(biāo)溶液。采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量分析，以目標(biāo)物定量離子峰面積和內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積的比值(y)對(duì)相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度(x，mg·L-1)進(jìn)行線性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。7種OH-PAHs在0.3～3 000 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.995 1。

使用對(duì)照尿液樣品溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子信噪比S/N=3和S/N=10計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得到7種OH-PAHs的LOD為0.05～1.0 mg·L-1，LOQ為0.15～3.0 mg·L-1(見(jiàn)表2)。

2.3.2回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在對(duì)照尿液樣品中添加3個(gè)水平的7種OH-PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，日內(nèi)(n=3)和日間(n=3)平行測(cè)定，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。如表2所示，7種OH-PAHs在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為70.8%～117%，日內(nèi)和日間RSD分別為3.7%～9.6%和3.7%～11%。方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

表2 7種OH-PAHs的線性關(guān)系、檢出限、定量下限及回收率Table 2 Linear relationships,LODs,LOQs and recoveries of seven OH-PAHs

2.4 實(shí)際樣品的分析

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，將方法應(yīng)用于10例石油工人尿液樣品與10例對(duì)照人群尿液樣品中7種OH-PAHs的測(cè)定，結(jié)果如表3所示。按OH-PAHs種類進(jìn)行分類，兩組人群體內(nèi)的7種OH-PAHs均有檢出，使用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)7種OH-PAHs 的濃度值進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，結(jié)果均呈非正態(tài)分布，因此人群尿液中7種OH-PAHs的含量采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示；石油工人與對(duì)照人群的差異性分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)，除2-OHPhe和9-OHPhe外，石油工人尿液中5種OH-PAHs的濃度均高于對(duì)照人群濃度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。圖3為對(duì)照尿液樣品及加標(biāo)樣品經(jīng)SLE處理后的7種OH-PAHs的MRM圖。

表3 石油工人和對(duì)照人群尿液樣品中7種OH-PAHs的分析結(jié)果(n=10)Table 3 Seven OH-PAHs concentrations in human urine samples from petroleum workers and control group(n=10)

* no detected;** no value

2.5 與文獻(xiàn)方法的對(duì)比

將本方法對(duì)尿液樣品中OH-PAHs的測(cè)定結(jié)果與常用的前處理方法(如LLE、SPE)進(jìn)行比較(表4)。結(jié)果顯示，本方法的準(zhǔn)確度和靈敏度良好，回收率與文獻(xiàn)相當(dāng)。此外，相比于LLE的試劑消耗量大，SPE的操作步驟繁瑣，SLE僅需上樣和洗脫兩步共10 min即可完成前處理工作，方法操作簡(jiǎn)單快速，且消耗有機(jī)溶劑少，基質(zhì)效應(yīng)低。

表4 本研究與文獻(xiàn)報(bào)道方法的對(duì)比Table 4 Comparison of the developed method with the reported methods for determination of OH-PAHs in urine samples

3 結(jié) 論

本研究建立了基于SLE結(jié)合UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定職業(yè)暴露工人尿液中7種OH-PAHs的分析方法。實(shí)驗(yàn)對(duì)SLE過(guò)程中的洗脫步驟進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了氮吹濃縮條件的影響。在最優(yōu)條件下，7種OH-PAHs在0.3～3 000 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.05～1.0 mg·L-1，定量下限為0.15～3.0 mg·L-1，加標(biāo)回收率為70.8%～117%。該方法簡(jiǎn)單、快速，為尿液中多環(huán)芳烴代謝物測(cè)定提供了新思路，對(duì)環(huán)境中多環(huán)芳烴分析以及對(duì)人體健康評(píng)價(jià)具有重要意義。