聚中性紅修飾玻碳電極的制備及其在抗菌藥物有效性檢測中的應用

何 迪，韓 笑，賀敬婷，陳立志，馬 燁，翟俊峰，劉 暢*

(1.錦州醫(yī)科大學 藥學院，遼寧 錦州 121000;2.中國科學院 長春應用化學研究所，吉林 長春 130000)

近年來，臨床上抗生素的廣泛應用以及局部存在的不合理、不規(guī)范用藥現(xiàn)象，使得細菌耐藥性問題日趨嚴峻，引起了全世界的普遍關(guān)注。耐藥菌，尤其是多重耐藥菌的產(chǎn)生和傳播，給人和動物感染性疾病的治療帶來了極大困難[1-2]。因此，臨床和常規(guī)的細菌耐藥性測試對耐藥菌株的監(jiān)測和控制有著極其重要的意義。長期以來，抗生素的藥敏實驗作為細菌耐藥性檢測的重要方法和手段被廣泛應用，不僅為臨床上細菌感染性疾病的治療提供有力支持，并且為新藥開發(fā)和科學研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。傳統(tǒng)的藥敏實驗如肉湯稀釋法和紙片擴散法[3-4]，雖然可以獲知病原微生物的敏感抗生素，但存在耗時長、操作復雜以及難以提供藥物濃度和受試微生物被抑制率的準確關(guān)系等缺陷。因此，開發(fā)一種安全快速、方便實用的藥敏測試方法來監(jiān)測和檢測抗菌藥物有效性及細菌耐藥性具有重要意義。

中性紅(NR)作為一種堿性吩嗪染料，常被用于酸堿指示劑；又因其可以通過電引發(fā)-電聚合法制備聚中性紅(PNR)材料而被廣泛應用于電極表面修飾。研究表明：在較高的電位區(qū)間內(nèi)經(jīng)電引發(fā)，可以使中性紅產(chǎn)生陽離子自由基，該陽離子自由基與中性紅單體或另一個陽離子自由基反應生成中性紅低聚合物；在較低電位下，該低聚物即可氧化成相應的陽離子自由基，并進一步與中性紅單體或另一個陽離子自由基反應生成分子量更大的中性紅聚合物(PNR)[5-6]。PNR既保留了單體中性紅良好的氧化還原性，又通過修飾電極的方式避免了試劑浪費以及環(huán)境污染問題[7]。目前PNR修飾電極的應用主要集中在對過氧化氫[8]、葡萄糖[9]、谷氨酸[5]、多巴胺[10]、DNA[11]等方面的測定。此外，因中性紅結(jié)構(gòu)中具有氧化還原中心，在生物電化學實驗中可代替氧作為微生物呼吸作用所產(chǎn)生電子的最終接受體。本研究首次將PNR修飾玻碳電極(PNR/GCE)與抗菌藥物有效性的檢測聯(lián)系起來，以埃希氏大腸桿菌(E.coli)為受試菌株，將該生物電化學體系分別引入頭孢哌酮、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星4種常用抗菌藥物的有效性測試。實驗表明，最優(yōu)條件下制備的PNR/GCE穩(wěn)定性好，可反復多次用于同體系的電化學測試，對基于呼吸作用的生物活性的變化響應靈敏，且可以精確測得不同濃度抗菌藥物對受試微生物的抑制率。本方法所得藥敏實驗結(jié)果與傳統(tǒng)的紙片擴散法所得結(jié)果相一致，但操作更簡單，周期更短，因此可作為傳統(tǒng)藥敏實驗的補充方法，進一步應用于臨床細菌的耐藥性測試和抗菌藥物的有效性檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI832C電化學分析儀(上海辰華儀器公司)；三電極體系：裸玻碳電極(GCE)或PNR/GCE為工作電極，Ag/AgCl(3 mol/L KCl)為參比電極，鉑絲電極為對電極；KYC-100B空氣恒溫搖床(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司)；721可見分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)；SYQ-DSX-280B型壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械有限公司)；SW-CJ-1E潔凈工作臺100級(上海博迅實業(yè)有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。

1.2 修飾電極的制備

用0.05 μm的Al2O3粉在拋光布上將GCE表面拋光至鏡面，用水沖洗后依次用硝酸(體積比1 ∶ 1)、無水乙醇、水超聲清洗電極，每次3 min，晾干。將晾干后的GCE轉(zhuǎn)入0.5 mol/L H2SO4溶液中，于-0.5～1.6 V電位下進行循環(huán)掃描至循環(huán)伏安圖穩(wěn)定為止，取出后用水淋洗干凈，晾干備用。將處理后的GCE置于PBS+0.5 mol/L NaNO3+ 5.0×10-4mol/L NR體系，于-1.4～1.8 V電位下，以100 mV/s的掃描速率引發(fā)15圈，再于-0.8～0.8 V電位下聚合15圈，取出后用水淋洗干凈，即制成PNR/GCE，于PBS中保存。

1.3 E.coli的培養(yǎng)及處理

將LB培養(yǎng)基和PBS 于1.0×105Pa滅菌20 min，移至超凈臺，冷卻至室溫，待用。在無菌條件下，取20 μL已解凍的E.coli菌種接種至20 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min搖床中恒溫活化6 h。隨后，移取200 μL此活化菌液接種至330 mL LB培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后的菌液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，棄去上層培養(yǎng)基，菌體沉淀以PBS洗滌3次后，懸浮于適量PBS溶劑中。采用721可見分光光度計于600 nm處檢測菌懸液的光密度值(OD600)，并將其調(diào)節(jié)為0.5，以此菌懸液進行抗生素有效性檢測實驗。

1.4 抗菌藥物的有效性測定

平行配制7份溶液，成分均為45 mL預制備的菌懸液和5 mL新鮮配制的GGA(終濃度為220 mg/L)，并將其密封于電解池，在37 ℃、120 r/min的搖床中恒溫培養(yǎng)20 min。取1份上述菌懸液設(shè)為空白對照(無抗菌成分)，其余6份加入不同量的抗菌藥物，再移至37 ℃、120 r/min搖床中繼續(xù)恒溫培養(yǎng)40 min。因抗菌藥物的抑制作用，與空白對照中的菌體相比較，其余樣品中菌體的呼吸作用將有所減弱，產(chǎn)生的電子數(shù)量也相應減少。

圖1 基于PNR/GCE測定抗菌藥物有效性的原理Fig.1 Schematic diagram for the detection of antibacterial efficacy based on PNR/GCE

中性紅作為一種良好的電子媒介體，可通過細胞膜上酶的轉(zhuǎn)移作用接受微生物呼吸作用產(chǎn)生的電子，并還原為5,10-二氫中性紅。結(jié)合電化學分析儀，在-300 mV電壓下通過檢測5,10-二氫中性紅的氧化電流強度，即可衡量微生物在呼吸作用中產(chǎn)生的電子數(shù)量，并將其量化為活性，如圖1所示?？咕幬镉行钥刹捎脤Ρ冉】稻w和與抗菌藥物作用的菌體的活性差值獲得，本文以抑制率表示，公式為：Efficacy%=(Inor-Ianti)/Inor×100%，式中，Inor為氧化正常微生物呼吸作用產(chǎn)物的極限電流值；Ianti為氧化受抗菌藥物影響的微生物呼吸作用產(chǎn)物的極限電流值；Efficacy%為抗菌藥物有效性。

圖2 NR濃度對制備PNR/GCE的影響Fig.2 Effect of NR concentration on PNR/GCE preparation

圖3 pH值對NR電聚合的影響Fig.3 Effect of pH value on NR electropolymerization

2 結(jié)果與討論

2.1 電極修飾條件的優(yōu)化

2.1.1NR濃度的影響分別在濃度為0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L的NR溶液中進行電聚合，通過比較CV圖中峰電流大小考察了NR濃度對制備PNR/GCE的影響。如圖2所示，隨著NR濃度的增大，峰電流逐漸增大，當NR濃度增至0.5 mmol/L時，峰電流達到最大，表明此時的聚合效果最好，實驗結(jié)果與文獻[5]一致。繼續(xù)增加NR濃度至1.0 mmol/L，則峰電流無明顯變化。因此，選擇NR的最佳濃度為0.5 mmol/L。

2.1.2掃描段數(shù)的影響考察了掃描段數(shù)對NR聚合效果的影響。在聚合過程中，分別設(shè)定掃描段數(shù)為10、20、30和40。實驗結(jié)果顯示，初始階段隨著掃描段數(shù)的增加，PNR/GCE的峰電流值顯著增大，當掃描段數(shù)為30時，峰電流值達到最大，繼續(xù)增加掃描段數(shù)，峰電流值有所下降，且峰形變差。因此，實驗選擇NR在GCE表面電聚合的最佳掃描段數(shù)為Segment 30。

2.1.3緩沖溶液pH值的影響考察了緩沖體系pH值對聚合效果的影響，分別在pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的PBS緩沖溶液中制備PNR/GCE。如圖3所示，在pH值5.5～7.0范圍時，隨著溶液pH值的增大，PNR/GCE峰電流不斷增大，表明在此范圍內(nèi)隨著pH值的增大其聚合效果越來越好。但繼續(xù)增大溶液至pH 7.5時，峰電流值突然下降至低于pH 5.5時的峰電流值，表明NR在GCE表面的電聚合效果變差，且在聚合過程中，肉眼可觀察到部分NR沉淀。實驗結(jié)果表明，NR在偏酸性溶液中的聚合效果較中性環(huán)境差；在偏堿性溶液中，NR的溶解度小，更加不利于NR的電聚合。因此，后續(xù)實驗選擇中性環(huán)境pH 7.0作為NR在GCE表面的電聚合條件。

2.1.4支持電解質(zhì)NaNO3濃度的影響分別在濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L的NaNO3溶液中進行NR的電聚合反應，結(jié)果表明，當NaNO3濃度為0.1～0.5 mol/L時，隨著NaNO3濃度的增加，峰電流值增大，聚合效果更好；但繼續(xù)增大NaNO3濃度至0.7 mol/L時，峰電流值有所下降；當NaNO3濃度增至0.9 mol/L時，峰電流值顯著下降，且肉眼可觀察到聚合完成后，修飾液中出現(xiàn)NR沉積。推測高濃度電解質(zhì)導致NR電聚合效果變差的原因可能是由于其降低了NR分子的表面電位，使修飾液出現(xiàn)絮凝[12]。據(jù)此，后續(xù)實驗選擇0.5 mol/L NaNO3作為支持電解質(zhì)的最佳濃度。

2.2 修飾電極的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

取同一支PNR/GCE在PBS緩沖液中平行掃描10次CV圖，所得峰電流的相對標準偏差(RSD)僅為1.5%，表明該修飾電極的重現(xiàn)性良好。將上述修飾電極用水清洗后，置于4 ℃條件下于0.2 mol/L PBS(pH 7.0)中保存14 d，再在PBS緩沖液中掃CV圖，峰電流為新制備PNR/GCE的97.3%，表明該修飾電極具有良好的穩(wěn)定性。

圖4 E.coli濃度對藥敏實驗靈敏度的影響(左氧氟沙星濃度為5～30 mg/L)Fig.4 Effect of E.coli concentration on sensitivity of drug sensitivity experiment(Clevofloxacin=5-30 mg/L)

圖5 反應時間對藥敏實驗靈敏度的影響(左氧氟沙星濃度為5～30 mg/L)Fig.5 Effect of reaction time on sensitivity of drug sensitivity experiment(Clevofloxacin=5-30 mg/L)

2.3 藥敏實驗的條件優(yōu)化

2.3.1E.coliATCC25922使用濃度對藥敏實驗的影響本實驗選擇E.coli敏感且具有代表性的喹諾酮類抗菌藥左氧氟沙星用于篩選E.coli的最佳使用濃度，其濃度(OD600)梯度值分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0，左氧氟沙星濃度分別為5、10、15、20、25、30 mg/L。結(jié)果表明，經(jīng)1 h培養(yǎng)后，伴隨OD600值的下降，左氧氟沙星的有效性增強；當OD600值為0.5時，左氧氟沙星的有效性達到最大，其抑制率為38.6%～64.0%；繼續(xù)降低OD600值，左氧氟沙星的有效性不再增強，甚至有所降低(圖4)。即OD600值為0.5時，E.coli對左氧氟沙星最為敏感。

2.3.2反應時間對藥敏實驗的影響當受試微生物E.coli的濃度為0.5(OD600)時，以左氧氟沙星作為模型藥物，考察了不同反應時間對藥敏實驗靈敏度的影響。結(jié)果表明，當反應時間為10～40 min時，隨著反應時間的延長，藥物對E.coli生物活性的抑制作用不斷增強；然而，隨著反應時間在60～80 min內(nèi)增加，藥物對E.coli呼吸抑制作用逐漸減弱(圖5)，其原因可能是在長時間反應中，微生物代謝過程中的細胞色素P450酶生化反應使抗菌藥物發(fā)生了降解[13-14]。在保證藥敏實驗靈敏度的前提下，為減少測試時間并提高測試效率，后續(xù)實驗均選擇40 min作為最佳反應時間。

圖6 GGA濃度對藥敏實驗靈敏度的影響(左氧氟沙星濃度為5～30 mg/L)Fig.6 Effect of GGA concentration on sensitivity of drug sensitivity experiment(Clevofloxacin=5-30 mg/L)

2.3.3GGA溶液的影響文獻表明，營養(yǎng)物質(zhì)會對受試微生物的活性產(chǎn)生一定影響，進而影響體系的靈敏度[15]。但針對不同的體系，營養(yǎng)物質(zhì)的作用結(jié)果未必相同。因此，本研究在上述優(yōu)化條件下，即菌濃度OD600=0.5，培養(yǎng)時間為40 min，左氧氟沙星濃度為5～30 mg/L時，考察了GGA對藥物有效性的影響。結(jié)果顯示，GGA溶液的終濃度為220 mg/L(BOD5)時，5 mg/L左氧氟沙星對E.coli的有效性為38.6%；而當體系中無GGA存在時，30 mg/L左氧氟沙星對E.coli的有效性僅為29.1%，體系靈敏度下降(圖6)，其原因可能是細菌在饑餓時期對抗菌藥物的耐藥性增強[16]?？梢?，在本體系中，營養(yǎng)物質(zhì)GGA是提高電化學藥敏實驗靈敏度的關(guān)鍵因素之一。

2.4 抗菌藥物的有效性檢測

采用上述優(yōu)化實驗條件，以NR作為媒介體的電化學方法測定抗菌藥物有效性，將頭孢哌酮、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星和萬古霉素與E.coli(OD600=0.5)共同培養(yǎng)40 min。其中前4種抗菌藥物對E.coli具有強烈的抑菌效果，半數(shù)抑菌濃度(通常指能引起受試生物的某種效應50%抑制的濃度，此處指E.coli產(chǎn)生的電流值降低50%的濃度)分別為34.15、27.98、8.83、11.49 mg/L。由于萬古霉素只對革蘭氏陽性菌起作用，故其濃度高達80 mg/L時對E.coli的抑制率也僅為23.3%。

表1 頭孢哌酮、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星及萬古霉素對E.coli的紙片擴散法結(jié)果Table 1 Results of cefoperazone,amikacin,gentamycin, levofloxacin and vancomycin on E.coli by disk diffusion method

2.5 與紙片擴散法的比較

紙片擴散法作為傳統(tǒng)藥敏實驗方法常被用于檢驗電化學藥敏測試方法的可靠性，采用的藥物濃度以電化學藥敏測試方法得到的各種抗菌藥物的半數(shù)抑菌濃度為基礎(chǔ)，結(jié)果如表1所示。電化學藥敏實驗中所對應的半數(shù)抑菌濃度在紙片擴散法中產(chǎn)生相應的中度敏感的結(jié)果，頭孢哌酮、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星的抑菌圈直徑分別為10.2、10.9、11.5、13.9 mm；而針對革蘭氏陽性菌的萬古霉素，采用電化學藥敏試驗得到最大抑菌效果時的80 mg/L在紙片擴散法中仍為耐藥結(jié)果。顯然，電化學藥敏測試方法得到的結(jié)果與經(jīng)典的紙片擴散法具有良好的一致性。

3 結(jié) 論

本文通過對NR濃度、掃描段數(shù)、緩沖體系pH和支持電解質(zhì)NaNO3濃度等影響因素的優(yōu)化，成功制備了穩(wěn)定性好、重復性好、靈敏度高的PNR/GCE。以該修飾電極為工作電極，利用一定外加電壓下獲得的NR的極限電流值確定受試微生物E.coli的細胞活性，進而確定抗菌藥物對E.coli的抑制效果，據(jù)此建立了測定抗菌藥物有效性的電化學分析方法。結(jié)果表明，該PNR/GCE不僅可以用于抗菌藥物有效性的檢測，且相較于傳統(tǒng)的藥敏實驗，此方法更為快速簡便，可精確測得抗菌藥物的有效率，有望作為檢測抗菌藥物有效性傳統(tǒng)方法的補充用于臨床檢測和新藥研發(fā)等領(lǐng)域。