噴砂酸蝕對(duì)鈦網(wǎng)表面成骨細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究

劉巧榮，張娜娜，張旭英，謝麗梅，高育新，楊麗梅，路興華，石 磊

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

面部骨組織缺損重建和修復(fù)一直是外科手術(shù)治療的難點(diǎn)，目前臨床上常采用自體骨移植的方法進(jìn)行治療。但該方法存在修復(fù)骨來(lái)源有限、手術(shù)難度大、供區(qū)創(chuàng)傷大、可能出現(xiàn)并發(fā)癥等缺點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)利用新型材料取代自體骨移植成為近年來(lái)臨床研究的熱點(diǎn)。生物醫(yī)用材料是一類人工合成或天然的材料，機(jī)械強(qiáng)度高、力學(xué)性能好，臨床應(yīng)用較廣泛。鈦及鈦合金因其穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、廣泛的來(lái)源以及良好的抗腐蝕性等優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是骨科領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-2]。我們利用物理、化學(xué)及生物表面改性方法，對(duì)鈦網(wǎng)表面進(jìn)行處理，提高其粗糙度，促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附和增殖[3]。目前，這種經(jīng)過(guò)處理的材料已被廣泛用于口腔種植牙技術(shù)領(lǐng)域[4]，但在面部骨缺損重建和修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于探索階段。

噴砂酸蝕（SLA）是融合物理蝕刻和化學(xué)蝕刻的表面處理方法，是將鈦片或鈦網(wǎng)噴砂處理后再進(jìn)行酸蝕，從而使其表面形成大小不同的彈坑狀二級(jí)孔洞。處理后的鈦網(wǎng)表面粗糙，能增加與細(xì)胞的接觸面積，提高成骨細(xì)胞活性，利于骨細(xì)胞增殖和分化[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)兔頜面外周圍骨缺損動(dòng)物模型，將噴砂酸蝕處理前后的鈦網(wǎng)植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨缺損處，飼養(yǎng)一段時(shí)間后取出鈦網(wǎng)，觀察并對(duì)比噴砂酸蝕前后鈦網(wǎng)誘導(dǎo)成骨效果，為鈦網(wǎng)表面改性、重建上頜骨局部缺損提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

醫(yī)用鈦網(wǎng)，100 mm×80 mm×1 mm（西安中邦生物材料有限責(zé)任公司）；箱式噴砂機(jī)（百德機(jī)械設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus CX31）；發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM，JSM-6701F）；超聲波清洗器（CQ-500AD，上海躍進(jìn)）；Al2O3顆粒（北京環(huán)球金鼎科技有限公司），HCl、H2SO4（上海禹秦化工有限公司）；去離子水（＞18.2 MΩ·cm）。

1.2 噴砂酸蝕前后鈦網(wǎng)表面形貌觀察

將醫(yī)用鈦網(wǎng)用支架固定于噴砂箱內(nèi)，選用200～400 μm的Al2O3，在0.6 MPa壓強(qiáng)下噴砂30 s，保持噴嘴與鈦網(wǎng)表面垂直，兩者最近距離15 cm，依次用去離子水、無(wú)水丙酮、無(wú)水乙醇超聲清洗5 min，吹干備用。配制18%HCl和48%H2SO4混合酸蝕液，將鈦網(wǎng)置于其中酸蝕15 min，按上述方法清洗后取出干燥。利用掃描電鏡分析噴砂酸蝕處理前后鈦網(wǎng)表面形貌，利用三維形貌儀檢測(cè)其表面粗糙度。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

選擇6只新西蘭新生兔（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），雌雄不限，不計(jì)體質(zhì)量，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組植入未經(jīng)噴砂酸蝕處理的鈦網(wǎng)，實(shí)驗(yàn)組植入經(jīng)噴砂酸蝕處理的鈦網(wǎng)。實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)兔肌內(nèi)注射麻醉，待麻醉成功后按外科無(wú)菌操作方法切開(kāi)額部皮膚，在無(wú)菌生理鹽水冷卻下用球鉆定位，去除2 cm×2 cm的顱骨，植入未經(jīng)噴砂酸蝕處理的鈦網(wǎng)（對(duì)照組）或經(jīng)噴砂酸蝕處理的鈦網(wǎng)（實(shí)驗(yàn)組），沖洗創(chuàng)面，對(duì)位縫合創(chuàng)口。術(shù)后肌注慶大霉素，每日兩次，連用7天。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1粗糙度 利用三維形貌掃描儀對(duì)實(shí)驗(yàn)兔三維形貌特征進(jìn)行分析，測(cè)量其鈦網(wǎng)表現(xiàn)粗糙度并建立三維立體圖像。

1.4.2表面骨質(zhì) 連續(xù)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6個(gè)月，之后切開(kāi)植入鈦網(wǎng)處皮膚及骨膜，小心解剖分離原植入?yún)^(qū)域，注射過(guò)量戊巴比妥鈉致實(shí)驗(yàn)兔死亡，取出鈦網(wǎng)并置于福爾馬林固定液中浸泡，觀察對(duì)比兩組鈦網(wǎng)表面成骨效果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件包處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)量資料以（x±s）表示，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 鈦網(wǎng)表面形貌

對(duì)照組鈦網(wǎng)表面可見(jiàn)方向一致的劃痕（掃描電鏡，2 000倍），比較光滑（見(jiàn)圖1a、c），實(shí)驗(yàn)組鈦網(wǎng)表面生成了形態(tài)不規(guī)則、類似蜂窩狀的孔洞（見(jiàn)圖1b、d）。表面形貌圖中顏色的變化代表垂直方向上各點(diǎn)相對(duì)高度的差異（見(jiàn)圖1c、d），顏色深淺代表縱深度的深淺，即顏色越豐富，高度差異越大，表面越粗糙。說(shuō)明噴砂酸蝕可增加鈦網(wǎng)表面粗糙度，增大與成骨細(xì)胞的接觸面積，有利于成骨細(xì)胞形成。

圖1 噴砂酸蝕處理前后鈦網(wǎng)表面形貌

2.2 鈦網(wǎng)表面粗糙度

對(duì)照組表面平均粗糙度為（0.26±0.01）μm，實(shí)驗(yàn)組表面平均粗糙度為（2.36±0.09）μm，組間差異有顯著性（P＜0.05）。

2.3 表面骨質(zhì)

6個(gè)月后，兩組鈦網(wǎng)表面均有骨組織生成，但對(duì)照組鈦網(wǎng)誘導(dǎo)生成骨組織能力差，生成的骨組織量少且不連續(xù)；而實(shí)驗(yàn)組鈦網(wǎng)表面則形成了連續(xù)骨組織，骨量較多（見(jiàn)圖2a、d）。圖2c、d為鈦網(wǎng)表面骨組織切片染色結(jié)果。其中，對(duì)照組骨組織疏松且不緊密，實(shí)驗(yàn)組骨組織較為緊密且連續(xù)，說(shuō)明粗糙結(jié)構(gòu)更適合誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成骨組織，植入經(jīng)噴砂酸蝕處理的鈦網(wǎng)能夠誘導(dǎo)骨組織生成，長(zhǎng)期植入可形成薄的骨質(zhì)。

3 討論

3.1 以新西蘭新生兔作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目尚行?/h3>

建立動(dòng)物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的重要方法和手段，可以避免在人身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，且實(shí)驗(yàn)容易復(fù)制，便于操作和采集標(biāo)本，備受學(xué)者青睞。目前，用于骨缺損研究的動(dòng)物有鼠、馬、兔、豬、狗、羊等，但都有一定的局限性。如小動(dòng)物模型（嚙齒類）體積小、手術(shù)操作困難，大動(dòng)物（狗、豬、馬等）價(jià)格昂貴、來(lái)源困難、飼養(yǎng)條件要求高。兔模型為骨組織修復(fù)和重建研究提供了一個(gè)更合適的小動(dòng)物模型[6-7]，由于其體積適中，便于手術(shù)和標(biāo)本處理，繁殖、飼養(yǎng)以及麻醉、解剖等技術(shù)較成熟，因此被越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床骨組織修復(fù)研究領(lǐng)域。

3.2 SLA對(duì)鈦網(wǎng)表面粗糙度和表面骨質(zhì)的影響

圖2 鈦網(wǎng)表面成骨效果圖

鈦及其合金是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的金屬材料之一。在骨缺損治療中，鈦及其合金可作為植入裝置，替代損壞或缺損的組織。近年來(lái)，相關(guān)研究多集中在鈦及其合金表面改性方法上，如鈦漿噴涂、羥基磷灰石涂層、微弧氧化、激光照射及陽(yáng)極氧化法等[8]。研究發(fā)現(xiàn)，非涂層的移植體表面處理相對(duì)于涂層的表面處理方法更有優(yōu)勢(shì)[9]。目前，國(guó)內(nèi)外使用最為廣泛的非涂層表面處理方法是噴砂酸蝕，其原理是在特定壓力條件下和時(shí)間內(nèi)，將一定大小的Al2O3通過(guò)高速氣流噴射到種植體表面，形成凹陷，然后用酸性溶液處理種植體表面，使其產(chǎn)生大量微孔。噴砂酸蝕結(jié)合了物理蝕刻和化學(xué)蝕刻的優(yōu)點(diǎn)，造價(jià)低廉，簡(jiǎn)單易行。研究證實(shí)，種植體表面的粗糙度與其表面的新生骨量呈正相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)以噴砂酸蝕處理醫(yī)用鈦網(wǎng)，使其表面形成形態(tài)不規(guī)則的蜂窩狀的孔洞，6個(gè)月后在其上生成的骨量較光滑表面多。究其原因，我們認(rèn)為SLA是一種具有代表性的鈦種植體表面處理方法，被應(yīng)用于多種知名種植系統(tǒng)表面處理，可使鈦表面形成多級(jí)微米級(jí)形貌，不僅能有效增大表面積，還可在一定程度上增強(qiáng)成骨細(xì)胞黏附及增殖能力。細(xì)胞黏附是骨細(xì)胞增殖及分化的前提，而早期黏附與生物材料的表面形貌密切相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)以植入未經(jīng)噴砂酸蝕處理鈦網(wǎng)的實(shí)驗(yàn)兔作為對(duì)照組，以植入經(jīng)噴砂酸蝕處理鈦網(wǎng)的實(shí)驗(yàn)兔作為實(shí)驗(yàn)組，觀察6個(gè)月后鈦網(wǎng)表面骨組織生成情況。研究結(jié)果表明，經(jīng)噴砂酸蝕處理的鈦網(wǎng)表面形成大量蜂窩狀凹陷，與光滑表面相比，與成骨細(xì)胞接觸面積更大，更有利于誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成骨組織，促進(jìn)骨質(zhì)早期形成。