來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖凋亡的影響及其作用機(jī)制

劉玨 張瀟迪 張群鋒

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科（湖南衡陽421001）

研究發(fā)現(xiàn)，芳香化酶在子宮肌瘤組織中過度表達(dá)，是合成雌激素的重要酶［1］。高度特異性的來曲唑是人工合成的第3 代非甾體類芳香化酶抑制劑，可抑制芳香化酶而降低激素水平，進(jìn)一步消除或減輕雌激素刺激腫瘤生長的作用［2-3］。目前，來曲唑已在子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等許多雌激素依賴性腫瘤治療中發(fā)揮關(guān)鍵的作用［4］。本研究擬探討來曲唑作用雌二醇（E2）、B 細(xì)胞淋巴瘤-2 基因（bcl?2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase?3）的表達(dá)對子宮肌瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為臨床治療子宮肌瘤提供新治療途徑與借鑒。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與細(xì)胞培養(yǎng) 選取2015年3月至2016年1月在南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院手術(shù)切除的的8 例子宮肌瘤標(biāo)本（病理學(xué)證實(shí)）。無菌條件下取肌瘤組織約1 cm3，放入4 ℃、無菌、含抗生素的PBS 緩沖液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)室。PBS 洗滌3 遍后剪碎至＜1 mm3，離心管內(nèi)靜置，去上清后加入含800 U/mL I 型膠原酶的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃消化成單個(gè)細(xì)胞后用PBS 液終止消化。過濾細(xì)胞懸液后經(jīng)1 500 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞。加入DMEM 懸浮并接種，置于含5% CO2的37 ℃恒溫箱里培養(yǎng)24 h 后，觀察細(xì)胞貼壁的生長情況。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底接近80%～90%時(shí)即可傳代。用臺盼藍(lán)染色，觀察細(xì)胞活性并記數(shù)，在24 孔細(xì)胞培養(yǎng) 板接種5 × 105/mL 后在含5% CO2的37 ℃恒溫箱里繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞用α?actin 抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)法染色鑒定。后續(xù)實(shí)驗(yàn)取對數(shù)期細(xì)胞分為5 組，空白組加入相同量的DMSO 子宮肌瘤細(xì)胞，與4 組10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L不同濃度的來曲唑組。DMSO 溶解來曲唑且濃度低于1%。

1.2 材料與試劑 胎牛血清（FBS，Hyclone 公司）；RPMI?1640 細(xì)胞培養(yǎng)液（美國GIBCOBRL）；MTT（華美生物）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，江蘇鴻聲）；Western blot 試劑、免疫熒光試劑（上海碧云天）；0.25%胰酶（吉泰科技）；免疫組化試劑（SP9000 試劑盒、DAB 顯色劑）購自北京中杉金橋；臺盼藍(lán)等染色液及Triton X?100（10%）購自北京索萊寶；日本Takara 公司的RT?PCR 試劑（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I Mix PCR 試劑）；RT?PCR 引物（上海生工）；PVDF膜（0.45 μm，美國Millipore）；來曲唑原藥（美國Sigma?Aldridi）；兔抗人α?actin、bcl?2和caspase?3 抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（美國Santa Cruz）。

1.3 儀器與設(shè)備 3111 型CO2培養(yǎng)箱、CL17R 型冷凍高速離心機(jī)均購自Thermo Forma 公司；低溫冰箱購自SANYO公司；上海中順SENCO R?201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；蘇州安泰的SW?CJ?1F 層流超凈生物學(xué)工作臺；美國Dynatech 公司的EPICS XL 型流式細(xì)胞儀；美國BioTek 公司的ELX808 酶聯(lián)免疫檢測儀；美國Bio?Rad 公司的蛋白印記檢測系統(tǒng)與凝膠成像儀；Step One PLUS 熒光定量PCR 儀；羅氏480 熒光定量PCR 儀，Leica Bond?Max 免疫組化儀，Bio?Rad S1000 梯度PCR 儀；日本Olympus 公司的XPS?18 型倒置熒光顯微鏡。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 MTT 試驗(yàn) 用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，將1×105/mL 接種于96 孔板中，封閉，鋪板，調(diào)零，加入來曲唑，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每日測定每組細(xì)胞的吸光值（A）值。實(shí)驗(yàn)終止前4 h，添加20 μL MTT試劑，繼續(xù)孵育＞4 h。每孔添加200 μL DMSO，振蕩10 min，測定490 nm 處A值，繪制生長曲線。細(xì)胞增殖抑制率（%）=1-（A藥物組-A空白組）/（A細(xì)胞對照組-A空白組）×100%。

1.4.2 細(xì)胞凋亡率檢測細(xì)胞增殖能力 來曲唑作用對數(shù)期細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液用PBS 洗2 次，加入400 μg/mL 碘化丙啶，10 μg/mL Rnase，300 μL Triton?100，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。在室溫下避光染色20 min 后，流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4.3 測定E2含量 來曲唑作用72 h后，3 000 r/min離心20 min，棄上清液，-20 ℃凍存。采用放射免疫法測定E2 水平。

1.4.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT?PCR） 采用Trizol 試劑提取各組總RNA，并制備cDNA。將β?actin為內(nèi)參照物，定量檢測bcl?2、caspase?3 mRNA表達(dá)水平。其中，β?actin 引物序列，上游5′?CCAT?CATCTTGCAGGAGCG?3′，下游5′?CTGGCAGTGA?GCTATACTCG?3′；bcl?2 引物序列，上游5′?TCTG?GTCCCTTCCAGCTAGT?3′，下游5′?CAGGGAGGCT?AAGGGGTA?3′；Caspase?3 引物序列，上游5′?CT?TTCTCAAGGACCACCG?3′，下游5′?TCACTTGGCA?TACAAATCA?3′；將cDNA、引物和SYBR Green 混合，分別在94 ℃、50 s，55 ℃、50 s，72 ℃、50 s，72 ℃、10 min，循環(huán)40 次，用焦碳酸二乙酯補(bǔ)齊20 μL 體系。每組均設(shè)復(fù)孔3 個(gè)，每次重復(fù)3 次，對每個(gè)樣品CT 值按照2?ΔΔCT法統(tǒng)計(jì)分析mRNA 表達(dá)水平。

1.4.5 Western blot 法檢測bcl?2、Caspase?3 蛋白表達(dá) 檢測各組總蛋白，利用8% SDS?PAGE 電泳50 μg總蛋白后，轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗，4 ℃孵育12 h。TBST 清洗3 次，10 min/次，加入1∶300 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，重復(fù)清洗，最后暗室曝光檢測蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖的影響 與來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞增殖抑制率呈時(shí)間與濃度呈正相關(guān)（均r＞0.7，均P＜0.05）。見圖1。

2.2 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞凋亡率的影響 來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率呈時(shí)間與濃度呈正相關(guān)（均r＞0.8，均P＜0.05）。見圖2。

2.3 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞分泌E2 的影響 與來曲唑0 mol/L 組比較，隨著藥物濃度的增加，E2水平明顯降低（P＜0.05），而來曲唑濃度呈越高E2水平越，呈濃度負(fù)相關(guān)性（均r＜-0.6，均P＜0.05）。見圖3。

2.4 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞bcl?2、caspase?3 表達(dá)的影響 來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞72 h 后，bcl?2、bcl?2 mRNA 蛋白表達(dá)水平隨來曲唑濃度增加而降低（P＜0.05），與濃度呈負(fù)相關(guān)（均r＜-0.7，均P＜0.05）；而caspase?3、caspase?3 mRNA 蛋白表達(dá)水平隨來曲唑濃度增加而上升，與濃度呈正相關(guān)（均r＞0.8，均P＜0.05）。見圖4、5。

圖1 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞增殖的影響（n=8）Fig.1 Effect of letrozole on proliferation of uterine leiomyoma cells

3 討論

研究表明，來曲唑抑制雌激素合成后，既不會使雄激素在體內(nèi)大量積蓄，也不會影響孕激素水平，同時(shí)也不會降低腎上腺皮質(zhì)醇和醛固酮水平［3］。來曲唑不同于其他非甾體芳香化酶抑制劑，其結(jié)合亞鐵血紅蛋白中的鐵原子，能可逆地抑制芳香化酶與雄激素底物結(jié)合，阻斷雄激素催化為雌激素，不影響其他甾體激素生物合成［5］。人體的藥代動力學(xué)研究表明［6］，口服來曲唑的生物利用度高達(dá)99.9%，可快速阻斷雌激素合成路徑，快速降低雌激素水平，縮小子宮及肌瘤體積；同時(shí)來曲唑半衰期長，且?guī)缀跛写x產(chǎn)物經(jīng)腎臟排泄，毒副作用非常小。目前，來曲唑治療子宮肌瘤的研究較少，鮮有系統(tǒng)的體外實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。

圖2 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞凋亡率的影響（n=8）Fig.2 Effect of letrozole on apoptosis rate of uterine leiomyoma cells

圖3 來曲唑?qū)ψ訉m肌瘤細(xì)胞分泌E2 的影響（n=8）Fig.3 Effect of letrozole on E2 secretion in uterine leiomyoma cells

圖4 Western blot 法檢測各組bcl?2、caspase?3 的表達(dá)Fig.4 The expression of bcl?2 and caspase?3 in each group by western blot

WHYNOTT 等［7］研究顯示，促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH?α）具有保護(hù)宮頸癌患者的卵巢功能，縮小肌瘤體積。SCARPELLINI 等［8］研究認(rèn)為芳香化酶抑制劑在治療晚期和復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌方面的臨床益處有限，而RASDOSLAW 等［9］發(fā)現(xiàn)芳香化酶抑制藥與老年女性患者雌激素分泌密切相關(guān)。BOGLIOLO 等［10］認(rèn)為芳香化酶是合成雌激素的重要酶，影響著子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究組早前研究［11］發(fā)現(xiàn)利用來曲唑與GnRH?α 治療子宮肌瘤體積均明顯減小，但來曲唑治療患者的血清學(xué)改變，GnRH?α 治療患者的激素水平降低。ZHOU 等［12］研究發(fā)現(xiàn)來曲唑治療能顯著降低子宮肌瘤的大小和促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡。本研究顯示，來曲唑處理子宮肌瘤細(xì)胞后呈濃度與時(shí)間正相關(guān)。

圖5 來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞72 h 后對子宮肌瘤細(xì)胞bcl?2、Caspase?3 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of letrozole on expression of bcl?2 and caspase?3 in uterine leiomyoma cells after 72 h treatment

ZHENG 等［13］研究表明bcl?2 在正常子宮肌層中呈低表達(dá)，在子宮肌瘤組織中呈高表達(dá)。本研究顯示來曲唑能抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)來曲唑作用子宮肌瘤細(xì)胞表現(xiàn)出與濃度呈正相關(guān)，其機(jī)制可能與來曲唑下調(diào)bcl?2 表達(dá)和上調(diào)caspase?3 表達(dá)有關(guān)。此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)來曲唑顯著性降低了子宮肌瘤細(xì)胞E2 水平。因此，推測高濃度來曲唑除了抑制芳香化酶的表達(dá)，降低E2 合成，抑制肌瘤細(xì)胞增殖，還可能存在直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其能否直接誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，來曲唑可能的通過下調(diào)bcl?2 和上調(diào)caspase?3 表達(dá)及降低E2 水平，來發(fā)揮抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。但來曲唑抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡的機(jī)制有待更多的作用途徑與信號通路的深入研究。