PO/AH區(qū)注入RN-1734對(duì)孕酮致大鼠體溫升高的影響

段雨岑，施 蓓，鄭曉嬌，蘇詩(shī)萌，曹 宇

(1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122；2. 沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽(yáng) 110011)

機(jī)體的體溫是保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要因素之一，除病理性體溫明顯升高或降低以外，通常還表現(xiàn)出體溫的生理性波動(dòng)，特別是女性在月經(jīng)周期表現(xiàn)為雙相體溫的變化，即在卵泡期體溫較低，在排卵后基礎(chǔ)體溫升高約(0.3～0.6) ℃。關(guān)于月經(jīng)周期中的黃體期體溫升高的機(jī)制，通常認(rèn)為是孕酮作用在下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，進(jìn)而改變新陳代謝水平或皮膚血流量，但其作用的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制還不清楚[1]。

瞬時(shí)受體電位香草酸受體4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential,TRP)蛋白家族成員之一，是位于細(xì)胞膜上的一種重要的離子通道，參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)過程。目前的研究表明，該通道是一種多向的非選擇性陽(yáng)離子通道，可透過Ca2+、K+、Mg2+和Na+，但Ca2+的通透率相對(duì)較高[2-3]。在體內(nèi)，TRPV4可被多種刺激所激活，包括物理因素(如溫度、滲透壓等)、內(nèi)源性和外源性化學(xué)因素(如特異性激動(dòng)劑等)以及低pH值(pH<6)[4]。隨著對(duì)其溫度感受特性和滲透壓感受特性的研究，TRPV4已被視為體內(nèi)的熱傳感器和滲透壓傳感器[5]。TRPV4通道在哺乳動(dòng)物大多數(shù)組織中均有表達(dá)，包括外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)在下丘腦、海馬、皮層等部位[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在體溫調(diào)節(jié)中樞下丘腦前部有TRPV4的表達(dá)，且在機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)過程中，特別是對(duì)正常體溫的維持起重要的作用[7]。本研究主要探討TRPV4是否參與♀大鼠性周期中孕酮致體溫升高的過程。通過預(yù)先在體溫調(diào)節(jié)中樞視前區(qū)-下丘腦前部(preoptic-anterior hypothalamus area,PO/AH)給予TRPV4特異性阻斷劑RN-1734[8-9]，觀察RN-1734對(duì)大鼠動(dòng)情后期體溫的影響；進(jìn)一步在去卵巢大鼠腹腔注射孕酮后，于PO/AH區(qū)給予RN-1734，觀察體溫的變化，以明確體溫升高與孕酮及TRPV4通道的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康♀SD大鼠，體質(zhì)量240～260 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證和使用許可證號(hào)分別為:SCXK(遼)013-0001、SYXK(遼)013-0007。飼育室溫度(20 ± 2)℃，晝夜光照節(jié)律12 h ∶12 h，相對(duì)濕度40%～60%，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周。以下實(shí)驗(yàn)每組均采用6只動(dòng)物。

1.1.2試劑 孕酮、TRPV4特異性阻斷劑RN-1734，均購(gòu)自MedChem Express公司。

1.1.3儀器 無(wú)線BW-200數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(SIEMENS IMMULITE?2000 XPI[1])。

1.2方法

1.2.1大鼠動(dòng)情周期的觀察 每天于7 ∶30～8 ∶30開始，將待查♀鼠置于空籠子鐵絲蓋上，用拇指和食指捏住其尾，其余3指壓于后腰背部，露出陰道口，將小棉簽從陰道口插入陰道并且緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)，抽出后，將黏液均勻涂在載玻片上，待載玻片變干，進(jìn)行HE染色，用顯微鏡觀察細(xì)胞類型的形態(tài)。并將♀大鼠隨機(jī)分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。

1.2.2觀察大鼠在性周期中的體溫變化及孕酮水平 應(yīng)用生理無(wú)線遙測(cè)系統(tǒng)(BW-200)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠體溫。將大鼠用10%水合氯醛(3 mg·kg-1)腹腔麻醉，放置在超凈臺(tái)內(nèi)，仰臥位，四肢固定，腹部用酒精棉消毒，沿腹中線剪開，埋入體溫檢測(cè)發(fā)射子，將腹部縫好，用碘伏消毒傷口處，腹腔注射40 000 IU青霉素，處理完畢后，單獨(dú)飼養(yǎng)1周后，連續(xù)觀察兩個(gè)動(dòng)情周期，監(jiān)測(cè)其體溫變化。之后分別在動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期相應(yīng)時(shí)相，取血液樣本，將樣本存放在抗凝管中，經(jīng)3 000 r·min-1水平離心10 min，取上清液(即血漿)，置入EP管，-70 ℃保存。然后，將取上清液，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血中孕酮濃度。

1.2.3觀察不同孕酮水平對(duì)去卵巢大鼠體溫的影響 去卵巢大鼠模型：大鼠麻醉后俯臥位，以肋下1 cm、脊柱旁2 cm處為中心除毛，切開皮膚。在皮膚和肌肉之間擴(kuò)張、剝離，見包繞卵巢的脂肪組織及緊密相連的子宮，將其拉出，在子宮角的輸卵管的部位結(jié)扎，切斷子宮角，將卵巢摘除后，撒以青霉素粉，分別縫合腹膜與肌層和皮膚。飼育1周后，通過觀察陰道分泌物，以明確無(wú)明顯動(dòng)情周期。連續(xù)觀察10 d(約兩個(gè)動(dòng)情周期)體溫變化，確認(rèn)體溫平穩(wěn)之后，將大鼠隨機(jī)分為：① 正常對(duì)照組(Control)：腹腔注射0.1 mL生理鹽水；② 溶劑組(Solvent)：腹腔注射0.1 mL溶劑(乙醇 ∶麻油=1 ∶4)；③ 孕酮組(Progesterone，用上述溶劑溶解)：腹腔注射孕酮(1 、5、25 mg·kg-1)各0.1 mL，觀察不同劑量孕酮對(duì)機(jī)體體溫的影響。

1.2.4觀察PO/AH給予RN-1734對(duì)正常大鼠動(dòng)情后期體溫波動(dòng)的影響 將大鼠腹腔麻醉后，暴露前囟。在顱骨冠狀縫下0.3 mm、矢狀縫旁0.8 mm處鉆孔，將高度為6.4 mm引導(dǎo)管垂直插入PO/AH區(qū)，固定導(dǎo)管。單籠飼養(yǎng)1周后，連續(xù)觀察兩個(gè)動(dòng)情周期大鼠的體溫，明確動(dòng)情后期出現(xiàn)體溫最高點(diǎn)的時(shí)相，在動(dòng)情后期體溫到達(dá)最高點(diǎn)前2 h(通過前期實(shí)驗(yàn)表明阻斷劑RN-1734在第2 h作用最大)，于PO/AH區(qū)分別注射1 μL的生理鹽水、溶劑(乙醇 ∶芝麻油=1 ∶4)和阻斷劑RN-1734(0.002 3 μg·kg-1，用上述溶劑溶解),觀察不同實(shí)驗(yàn)條件下的體溫波動(dòng)情況。

1.2.5在預(yù)先給予孕酮的去卵巢大鼠的PO/AH給予RN-1734，觀察體溫波動(dòng)的變化 將去卵巢大鼠隨機(jī)分為4組：① 正常對(duì)照組(Control)：腹腔注射0.1 mL溶劑(乙醇 ∶芝麻油=1 ∶4)，10 h后，在PO/AH區(qū)注射1 μL溶劑；② 阻斷劑組(RN-1734)：腹腔注射0.1 mL溶劑，10 h后，在PO/AH區(qū)注射1 μL阻斷劑RN-1734(0.002 3 μg·kg-1)；③ 孕酮組(Progesterone)：腹腔注射0.1 mL孕酮(5 mg·kg-1)，10 h后，在PO/AH區(qū)注射1 μL溶劑；④ 孕酮+阻斷劑組(Progesterone+RN-1734)：腹腔注射0.1 mL孕酮(5 mg·kg-1)，10 h后，在PO/AH注射RN-1734阻斷劑1 μL(0.002 3 μg·kg-1)。觀察不同實(shí)驗(yàn)條件下，大鼠的體溫波動(dòng)變化。

2 結(jié)果

2.1陰道涂片確定大鼠動(dòng)情周期取大鼠陰道分泌物，經(jīng)涂片、HE染色，顯微鏡下觀察各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)如下：動(dòng)情前期可見大量圓形有核細(xì)胞(Fig 1A)；動(dòng)情期可見大量不規(guī)則角化細(xì)胞(Fig 1B)；動(dòng)情后期可見圓形有核細(xì)胞、角化細(xì)胞、白細(xì)胞3種細(xì)胞并存(Fig 1C)；動(dòng)情間期可見大量體積小的白細(xì)胞(Fig 1D)。

Fig 1 HE staining of vaginal secretion on rats(scale bar: 100 μm)

A:Proestrus; B: Oestrus; C: Metestrus; D: Diestrus.

Tab 1 Progesterone concentration in blood and temperature change of rats in estrus

2.3去卵巢大鼠給予不同劑量孕酮時(shí)的體溫變化Fig 2顯示了給予去卵巢大鼠孕酮(1、5、25 mg·kg-1)、溶劑和正常對(duì)照組的體溫變化情況。結(jié)果表明，給予孕酮后，出現(xiàn)了劑量依賴性體溫升高，即劑量越大，體溫升高幅度越大。實(shí)驗(yàn)表明，給藥12 h后體溫升高幅度最大，依據(jù)孕酮?jiǎng)┝坑傻椭粮?，其體溫分別達(dá)到(39.31±0.06)℃、(39.48±0.07)℃、(39.58±0.08)℃，在給藥24 h后，體溫基本恢復(fù)為基礎(chǔ)體溫。Tab 2為不同實(shí)驗(yàn)條件下，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)體溫與基礎(chǔ)體溫(實(shí)驗(yàn)前1周，應(yīng)用生理無(wú)線遙測(cè)系統(tǒng)，每隔5 min記錄1次體溫，取其時(shí)間點(diǎn)平均值記為基礎(chǔ)體溫)的差值，其中孕酮給藥濃度為5、25 mg·kg-1，體溫均在6 h和12 h時(shí)間點(diǎn)存在差異。

2.4大鼠動(dòng)情后期在PO/AH給予TRPV4特異性阻斷劑RN-1734后其體溫的變化如Fig 3所示，♀大鼠進(jìn)入動(dòng)情后期體溫開始明顯升高，體溫最高達(dá)(38.77±0.05)℃。然而，在PO/AH給予生理鹽水或溶劑時(shí)，兩組間動(dòng)情后期體溫變化無(wú)明顯差異。通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RN-1734在注射后第2 h發(fā)揮作用最明顯，所以選擇大鼠動(dòng)情后期體溫到達(dá)最高點(diǎn)前2 h，在PO/AH區(qū)給予RN-1734。通過阻斷劑組與正常對(duì)照組和溶劑組比較，發(fā)現(xiàn)阻斷劑組體溫升高幅度明顯降低，體溫低至(38.23±0.06)℃，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的體溫變化差值為大鼠動(dòng)情后期體溫升高的幅度(Tab 3)。從表中可看出，通過與動(dòng)情期的體溫進(jìn)行對(duì)比，RN-1734組注射后的1～5 h，體溫升高幅度明顯降低。

Fig 2 Curve of temperature change in ovariectomized rats administered with different concentrations of

Fig 3 Curve of temperature change on rats in metestrus after injecting specific antagonist

2.5去卵巢大鼠分別給予孕酮和/或RN-1734的體溫變化如Fig 4所示，去卵巢大鼠腹腔注射孕酮(5 mg·kg-1)12 h后，體溫明顯升高，達(dá)到高峰，體溫最高達(dá)(39.58±0.08)℃。給予孕酮(5 mg·kg-1)后10 h，在PO/AH區(qū)給予RN-1734，體溫升高幅度明顯下降，體溫為(39.10±0.10)℃。在未給予孕酮的去卵巢大鼠PO/AH區(qū)注射阻斷劑RN-1734，體溫升高幅度亦下降，但預(yù)先給予孕酮的去卵巢大鼠給予阻斷劑后，體溫下降較未給予孕酮的去卵巢大鼠更明顯[12]。此外，Tab 4結(jié)果顯示，在PO/AH區(qū)注射阻斷劑RN-1734后，預(yù)先給予孕酮后12 h和14 h，大鼠體溫升高幅度的下降較未給予孕酮(溶劑對(duì)照)的去卵巢大鼠明顯(P<0.05)。

3 討論

機(jī)體的體溫水平是影響新陳代謝活動(dòng)的重要內(nèi)在條件，體溫過高會(huì)直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞；而體溫過低則影響代謝活動(dòng)、興奮的傳導(dǎo)等生理功能反應(yīng)。因此，體溫作為基本的生命體征之一，維持其相對(duì)穩(wěn)定至關(guān)重要。在育齡期女性，體溫隨月經(jīng)周期的波動(dòng)也具有其特定的生理意義，排卵前體溫降低，為精子進(jìn)入女性體內(nèi)提供適宜的溫度環(huán)境，而此后的體溫升高則有利于受精卵的發(fā)育等生殖過程。一直以來，對(duì)于排卵后體溫升高機(jī)制的認(rèn)識(shí)還只限于明確了與孕激素水平有關(guān)，更詳細(xì)的分子生物學(xué)機(jī)制還所知甚少。

Tab 2 Change of temperature in ovariectomized rats administered with different concentrations of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 3 Change of temperature on rats in metestrus after injecting specific antagonist

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 4 Change of body temperature of ovariectomized rats after injecting progesterone and/or specific antagonist

*P<0.05,**P<0.01vs

Fig 4 Curve of body temperature change on ovariectomized rats administered with progesterone and/or specific antagonist

TRPs蛋白家族的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于多種感覺功能的生物學(xué)機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí)。其中，與溫度感受有關(guān)的TRPs分子的相繼被發(fā)現(xiàn)，提供了揭示機(jī)體體溫調(diào)節(jié)的分子生物學(xué)機(jī)制的研究線索。作為TRPs蛋白家族成員之一的TRPV4在大多數(shù)哺乳動(dòng)物及人體的多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)，在成人背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)，有關(guān)TRPV4通道的溫敏特性的研究已取得了較多的成果[10]。TRPV4通道通過與多種物質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作用，其中包括微管結(jié)合蛋白、水通道蛋白-4、水通道蛋白-5、小窩蛋白-1等，使Ca2+濃度增加，進(jìn)而調(diào)節(jié)生理功能活動(dòng)。

目前已經(jīng)證明，在PO/AH區(qū)體溫調(diào)節(jié)中樞有TRPV4的表達(dá)，該通道蛋白的敏感溫度為35 ℃以上。研究證明，正常體溫條件下，阻斷TRPV4可出現(xiàn)體溫降低[11]。我們推測(cè)，育齡期女性基礎(chǔ)體溫在排卵后出現(xiàn)升高期，很可能與TRPV4的功能活動(dòng)有關(guān)。為此，在本研究中，首先驗(yàn)證了在月經(jīng)周期中大鼠體溫的變化與孕酮水平的相關(guān)性，進(jìn)而通過采用PO/AH區(qū)給予TRPV4特異性阻斷劑RN-1734抑制TRPV4通道活性的方法[12-13]，觀察了TRPV4對(duì)♀大鼠性周期體溫波動(dòng)的影響，結(jié)果可見給予特異性阻斷劑后，大鼠動(dòng)情后期體溫升高的幅度明顯降低。同時(shí)，我們還制備了去卵巢大鼠模型，觀察不同濃度孕酮致大鼠呈現(xiàn)劑量依賴性體溫升高的基礎(chǔ)上，也觀察到RN-1734能夠降低孕酮致體溫升高的幅度，進(jìn)一步說明了孕酮致體溫升高與TRPV4通道功能的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，在PO/AH區(qū)采用TRPV4通道特異性阻斷劑RN-1734能夠抑制孕酮致♀大鼠體溫升高的作用，提示了體溫調(diào)節(jié)中樞中的TRPV4通道可能參與了在動(dòng)情后期孕酮致體溫升高的過程，但相關(guān)的更詳細(xì)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及細(xì)胞反應(yīng)分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究。