無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查在輔助生育雙胎妊娠染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用價(jià)值

王東梅 楊潔霞 杜倩怡 王奕霞 彭海山 齊一鳴

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣州 廣東 511442)

染色體疾病是導(dǎo)致我國(guó)出生缺陷的主要原因之一。產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷的有效手段。胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal testing,NIPT) 是利用大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)對(duì)母體外周血中的胎兒游離DNA (cell free fetal DNA，cfDNA)進(jìn)行深度測(cè)序，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析后，獲取胎兒染色體信息的方法，具有安全準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已在臨床得到良好的應(yīng)用[1]。目前已有大量文獻(xiàn)證實(shí)NIPT在單胎妊娠常見(jiàn)染色體非整倍體篩查中的高準(zhǔn)確性，其中21、18、13-三體的準(zhǔn)確率分別是99%、97%、92%[2]。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)最新聲明指出NIPT能夠在不同年齡人群中替代傳統(tǒng)的非整倍體篩查方法，但雙胎妊娠及輔助生育人群仍為該技術(shù)的慎用人群。由于ART雙胎妊娠較為復(fù)雜，染色體非整倍體發(fā)生率及介入性檢查流產(chǎn)率均比單胎要高[3]，而目前用于其染色體非整倍體篩查的血清學(xué)技術(shù)準(zhǔn)確性較低，因此本研究通過(guò)檢測(cè)cfDNA對(duì)ART雙胎妊娠樣本及自然雙胎妊娠樣本進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查，以評(píng)估其篩查ART雙胎妊娠染色體非整倍體的可行性，同時(shí)也對(duì)ART雙胎妊娠樣本胎兒游離DNA 濃度進(jìn)行分析，以評(píng)估它對(duì)ART雙胎妊娠樣本的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查結(jié)果的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年1月至2018年8月在廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心接受NIPT檢測(cè)的雙胎妊娠孕婦樣本，分為ART組和自然妊娠對(duì)照組，其中通過(guò)ART方式受孕的476例，自然受孕的對(duì)照組402例。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核，孕婦在采血前均已簽署知情同意書。其他納入標(biāo)準(zhǔn)有：孕婦體重小于100 kg。夫妻雙方染色體均無(wú)明確的異常。

1.2 研究方法 用無(wú)菌的EDTA.K2抗凝管采集孕婦外周血10ml，4℃條件下保存，并在6h內(nèi)分離血漿。采用Magen磁珠法核酸提取試劑盒提取血漿游離DNA，以博奧晶芯胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測(cè)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，Life公司Ion proton平臺(tái)半導(dǎo)體測(cè)序法，進(jìn)行NIPT測(cè)序分析。若Z值在-3～3之間則評(píng)估為三體低風(fēng)險(xiǎn)，若Z>3則評(píng)估為三體高風(fēng)險(xiǎn)。

1.3 檢測(cè)后續(xù)處理NIPT高風(fēng)險(xiǎn)病例，建議孕婦行介入性產(chǎn)前診斷(羊水或臍血染色體核型分析)并隨訪；NIPT低風(fēng)險(xiǎn)病例，建議22～26周Ⅲ級(jí)超聲多普勒檢查，如發(fā)現(xiàn)胎兒有明顯的結(jié)構(gòu)異常，建議進(jìn)一步產(chǎn)前診斷，如未發(fā)現(xiàn)異常則建議定期產(chǎn)檢并隨訪；產(chǎn)后新生兒檢查未發(fā)現(xiàn)異常的，視為陰性結(jié)果。未產(chǎn)前診斷及失訪樣本不納入研究范圍。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)(百分比)表達(dá)，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本基本情況分析 878例樣本按受孕方式分成2組，其中ART雙胎妊娠476例，孕婦年齡22～50(32.86±4.52)歲，NIPT檢查時(shí)孕周11～33(16.84±3.88)周；對(duì)照組自然雙胎妊娠402例，孕婦年齡16～47(30.19±5.21)歲，NIPT檢查時(shí)孕周11～32(17.93±4.31)周；t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示兩組間孕婦年齡間有顯著性差異(t=-8.124，P<0.001)，孕周間也有顯著性差異(t=3.949，P<0.001)。兩組一般情況對(duì)比見(jiàn)表1。ART雙胎妊娠組高齡孕婦比例是36.1%，其中雙絨毛膜雙羊膜囊(dichorionic diamniotic，DCDA)和單絨毛膜雙羊膜囊(monochorionic diamniotic，MCDA)比例分別為75.4%和3.4%，自然雙胎妊娠組高齡孕婦比例是23.6%，其中DCDA和MCDA比例分別為40%和39.3%。

2.2 染色體非整倍體檢出情況 本次研究NIPT高風(fēng)險(xiǎn)檢出結(jié)果與后續(xù)核型分析具體情況見(jiàn)表2。ART雙胎妊娠組染色體非整倍體陽(yáng)性率為1.3%(6/476)，自然雙胎妊娠組為0.5%(2/402)。

476例ART雙胎妊娠樣本中，一共檢出7例三體高風(fēng)險(xiǎn)樣本，檢出率約為1.5%，分別為21-三體5例、18-三體1例、7-三體1例。進(jìn)一步介入性產(chǎn)前診斷核型分析證實(shí)病例1、2、3、4、5、6為真陽(yáng)性，均為雙胎之一陽(yáng)性，病例7為假陽(yáng)性。同時(shí)檢出1例病例8微缺失高風(fēng)險(xiǎn)樣本，經(jīng)產(chǎn)前診斷確定為假陽(yáng)性；真陽(yáng)性病例中，病例5、6孕婦年齡小于35歲，其余4例均為高齡妊娠，6例患者孕周從16～19周不等，胎兒濃度分別是7.5%、18.8%、30.6%、21.2%、13.1%、9.0%，絨毛膜性質(zhì)均為DCDA。

402例自然雙胎妊娠樣本中，一共檢出3例21-三體高風(fēng)險(xiǎn)樣本，檢出率約為0.7%。進(jìn)一步介入性產(chǎn)前診斷核型分析證實(shí)病例9、10為真陽(yáng)性，病例11為假陽(yáng)性。2例真陽(yáng)性病例均為高齡妊娠，孕周分別是16、18周，胎兒濃度分別是6.07%、19.8%，病例9未知絨毛膜性，病例10為DCDA。病例11為MCDA，胎兒濃度是5.4%。

表1 ART雙胎妊娠組及自然雙胎妊娠組孕婦一般情況

表2 高風(fēng)險(xiǎn)病例信息及核型分析結(jié)果

注：ART為輔助生育；NP為自然妊娠；BMI為身體質(zhì)量指數(shù)；DCDA為雙絨毛膜雙羊膜囊；MCDA為單絨毛膜雙羊膜囊

病例后續(xù)跟蹤隨訪，T21、T18真陽(yáng)性病例進(jìn)行了減胎手術(shù)，本研究所檢測(cè)的陰性樣本中未出現(xiàn)染色體非整倍體假陰性的案例。ART雙胎妊娠組結(jié)果陰性病例中有一例雙胎之一心臟超聲異常，經(jīng)羊水染色體微陣列分析提示為22q11.21有一個(gè)大小約為3.15Mb的缺失。比較NIPT在兩組中的篩查效能，具體情況見(jiàn)表3。

表3 NIPT對(duì)ART雙胎妊娠及自然雙胎妊娠的檢測(cè)效能比較

2.3 胎兒游離DNA濃度分析ART雙胎妊娠組平均游離DNA濃度為(12.51±5.96)%，自然雙胎妊娠組平均游離DNA濃度為(15.35±6.71)%，見(jiàn)表4。t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，2組間胎兒游離DNA濃度具有顯著差異(t=6.624，P<0.001)。自然雙胎妊娠組胎兒游離DNA濃度明顯高于ART雙胎妊娠組。

表4 2組間胎兒游離DNA濃度比較

3 討論

隨著高齡孕產(chǎn)婦的增加及輔助生育技術(shù)的發(fā)展，ART雙胎妊娠發(fā)生率越來(lái)越高。接受ART的孕婦大多為高齡及胚胎進(jìn)行了體外培養(yǎng)等因素，使得這類胎兒具有相對(duì)更高的染色體異常發(fā)治療生率[4]，對(duì)于這部分孕婦有必要進(jìn)行精準(zhǔn)的產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷。然而，臨床上廣泛應(yīng)用的多項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志物結(jié)合孕婦年齡、體重等信息及超聲軟指標(biāo)聯(lián)合的產(chǎn)前篩查方法假陽(yáng)性率較高[5]；侵入性產(chǎn)前診斷方法屬于診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于雙胎妊娠容易造成出血、感染及流產(chǎn)[6]，且報(bào)告周期較長(zhǎng)；ART妊娠胎兒本屬于珍貴兒，血清學(xué)篩查無(wú)法滿足ART孕婦的診斷需求，侵入性產(chǎn)前診斷又有流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，均難為孕婦接受。因此，臨床上需要一種無(wú)創(chuàng)、快速、早期且準(zhǔn)確地篩查雙胎妊娠胎兒染色體非整倍體異常的方法。自1997年Lo等[7]發(fā)現(xiàn)母體血漿中存在cfDNA后，高通量測(cè)序技術(shù)在篩查常見(jiàn)染色體非整倍體方面(21、18、13-三體)發(fā)展迅速，其具有非侵入性、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛推廣應(yīng)用。但目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查的準(zhǔn)確性和可行性評(píng)估主要是針對(duì)單胎妊娠進(jìn)行，而針對(duì)輔助生育雙胎妊娠群體的研究和運(yùn)用較少。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)ART雙胎妊娠樣本及自然雙胎妊娠樣本進(jìn)行了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前染色體非整倍體的篩查，并成功篩查出8例染色體三體陽(yáng)性樣本。

本研究中，針對(duì)常見(jiàn)的21、18、13號(hào)染色體非整倍體異常，ART雙胎妊娠組中T21、T18的PPV(陽(yáng)性預(yù)測(cè)值)、靈敏度、特異度均為100%。由于樣本量少，T13未檢出，故未做統(tǒng)計(jì)；自然雙胎妊娠組中T21的PPV(陽(yáng)性預(yù)測(cè)值)、靈敏度、特異度分別為66.7%、100%、99.7%。因樣本量少，未發(fā)現(xiàn)T18、T13，故未做統(tǒng)計(jì)。雙胎妊娠組染色體非整倍體陽(yáng)性率為1.3%(6/476)，自然雙胎妊娠組為0.5%(2/402)，ART雙胎妊娠組染色體非整倍體異常發(fā)生率較自然妊娠組高，可能與進(jìn)行輔助生育技術(shù)的人群特點(diǎn)(不孕不育原因及高齡偏多)有關(guān)。

ART雙胎妊娠組出現(xiàn)1例T7假陽(yáng)性，自然雙胎妊娠組出現(xiàn)1例T21假陽(yáng)性。假陽(yáng)性的出現(xiàn)原因有多種可能，包括母體染色體嵌合[8]、母體拷貝數(shù)變異[9]、早期雙胎之一消失[10](輔助生育技術(shù)中為保證存活率通常會(huì)植入2個(gè)胚胎，其中可能出現(xiàn)一胎停育，一胎繼續(xù)發(fā)育成雙胎的現(xiàn)象，若消失的一胎染色體異常則可能造成假陽(yáng)性)以及最常見(jiàn)的限制性胎盤嵌合[11]。本研究中，病例8的T7假陽(yáng)性考慮原因是限制性胎盤嵌合，病例11的T21假陽(yáng)性考慮原因是母體染色體嵌合，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究發(fā)現(xiàn)ART雙胎妊娠組提示一例20號(hào)染色體存在一個(gè)大小約22Mb的缺失，經(jīng)產(chǎn)前診斷證實(shí)為假陽(yáng)性；另外，在后續(xù)隨訪中發(fā)現(xiàn)ART雙胎妊娠組NIPT結(jié)果陰性病例中有一例雙胎之一心臟超聲異常，經(jīng)羊水染色體微陣列分析提示為22q11.21有一個(gè)大小為3.15Mb的缺失。該區(qū)域位于Digeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域，孕婦經(jīng)遺傳咨詢后接受減胎手術(shù)。NIPT目前的主要檢測(cè)范圍為21、18、13-三體綜合征，在針對(duì)全基因組范圍內(nèi)篩查的同時(shí)可發(fā)現(xiàn)一些染色體微缺失/微重復(fù)，但由于cfDNA的復(fù)雜性及測(cè)序覆蓋度等因素，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性/假陰性結(jié)果[12]。美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)指出對(duì)于cfDNA檢測(cè)微缺失的篩查尚未被臨床驗(yàn)證，其敏感性和特異性也沒(méi)有確信數(shù)據(jù)[13]。國(guó)際產(chǎn)前診斷學(xué)會(huì)(International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD)則表示NIPT擴(kuò)展檢測(cè)應(yīng)當(dāng)限定在研究清楚的微缺失/微重復(fù)綜合征范圍內(nèi)，并需要結(jié)合臨床[14]。郭可欣等[15]表明使用NIPT檢測(cè)5Mb以上，研究較明確的胎兒CNV具有一定的可行性。隨著技術(shù)的發(fā)展，目前NIPT-PLUS通過(guò)增加測(cè)序深度、改進(jìn)測(cè)序技術(shù)等可檢測(cè)大于3Mb的微缺失/微重復(fù)。

Sarno等[16]的研究發(fā)現(xiàn)雙胎胎兒部分的cf-DNA中位值較單胎低(8%比11%，P<0.0001)，取樣失敗率更高(9.4%比2.9%，P<0.0001)，且取樣失敗率隨著母親年齡及母親體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)值升高而升高，隨著CRL值增加而降低。取樣失敗中最重要的相關(guān)因素為體外受精(in vitro fertilization，IVF)，取樣失敗率在單胎中為9.5%，雙胎中為56.2%。另外，雙胎妊娠中cfDNA檢測(cè)比單胎更加復(fù)雜。雙胎妊娠按合子性質(zhì)分為單卵雙胎和雙卵雙胎，單卵雙胎由一個(gè)受精卵分裂形成，大多數(shù)情況下，單卵雙胎中2個(gè)胎兒的染色體核型是一致的，每個(gè)胎兒的患病風(fēng)險(xiǎn)與單胎妊娠相同。雙卵雙胎由兩個(gè)受精卵分別發(fā)育而成，其中2個(gè)胎兒的患病風(fēng)險(xiǎn)是獨(dú)立的，且較單胎妊娠高。但亦有報(bào)道單卵雙胎兩個(gè)胎兒核型不一致的情況，可能有以下兩種解釋[17]：一是減數(shù)分裂時(shí)染色體不分離導(dǎo)致形成一個(gè)24條染色體的配子與另一個(gè)正常的配子合成一個(gè)三體的受精卵，發(fā)育成雙胎后其中一個(gè)胚胎發(fā)生三體自救，隨機(jī)丟失一個(gè)額外的染色體，發(fā)育成二倍體胎兒(有1/3的概率形成單親二倍體)，另一個(gè)胚胎沒(méi)有發(fā)生三體自救，繼續(xù)發(fā)育成三體胎兒；二是受精卵是正常的二倍體，雙胎形成后其中一個(gè)胚胎染色體在有絲分裂中不分離，形成三體和單體兩種細(xì)胞系，單體系死亡，三體系發(fā)育成三體胎兒，另外一個(gè)胚胎繼續(xù)發(fā)育成一個(gè)正常的二倍體胎兒。若雙胎中出現(xiàn)三體異常，通常只有其中一個(gè)胎兒受累，而兩個(gè)胎兒分別對(duì)母血循環(huán)中貢獻(xiàn)的cfDNA量不同，有些甚至可以相差近兩倍[18，19]。若受累胎兒貢獻(xiàn)的濃度低于cfDNA成功分析至少需要的4%，而正常胎兒貢獻(xiàn)得多，則會(huì)導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。因此，雙胎中每個(gè)胎兒提供足夠的cfDNA或能區(qū)分每個(gè)胎兒所占的胎兒比例是雙胎篩查非整倍體的關(guān)鍵。梁德楊等[19]提出單核苷酸多態(tài)性測(cè)定基因組區(qū)域間胎兒部分的差異有助于判斷雙胎的合子性質(zhì)，對(duì)雙卵雙胎，可以確定每個(gè)胎兒所占的胎兒比例，但應(yīng)用于臨床仍然有待進(jìn)一步大樣本研究。本研究中ART雙胎妊娠組胎兒cfDNA濃度明顯低于自然雙胎妊娠組，可能是由于兩者的孕周計(jì)算方式不同或者是輔助生殖技術(shù)植入的胚胎在孕婦體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育速度不同于同期大小的自然雙胎妊娠造成的。由于無(wú)創(chuàng)篩查的判斷值(Z值)與母體血漿中胎兒游離DNA濃度呈一定的線性關(guān)系[20]，因此結(jié)果分析應(yīng)該充分考慮雙胎的絨毛膜性質(zhì)及胎兒游離DNA濃度的影響。

綜上所述，NIPT在篩查輔助生育雙胎妊娠染色體非整倍體中有一定可行性，且不受孕周限制，但也存在假陽(yáng)性與假陰性的局限性。對(duì)于陽(yáng)性病例我們?nèi)孕柽M(jìn)一步介入性產(chǎn)前診斷才可明確雙胎中哪一胎受累，但在大多數(shù)雙胎均正常的情況下，NIPT避免了不必要的侵入性檢查，減少了孕婦的焦慮與擔(dān)憂。NIPT陰性病例后續(xù)必須進(jìn)行超聲監(jiān)測(cè)以及常規(guī)產(chǎn)檢，發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)就診以及進(jìn)一步產(chǎn)前診斷。同時(shí)本研究中由于樣本數(shù)量較少，僅檢出8例三體高風(fēng)險(xiǎn)，陽(yáng)性率缺乏與單胎篩查的可比性。該技術(shù)在雙胎妊娠中的臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步大規(guī)模的臨床數(shù)據(jù)支持驗(yàn)證。