基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的含水蛭經(jīng)方抗腫瘤機制研究▲

曾 潔 麥榮云 阮景晟 鞠佳霓 王宗玉 陳 闖

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科，南寧市 530021，電子郵箱：zengjiehcc@163.com)

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，中藥復方是中醫(yī)臨床的主要形式，其機制尚未十分明確，是目前的研究熱點之一。針對藥效物質(zhì)的探索，目前已形成了不同模式的研究方法，例如基于協(xié)同作用研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，利用軟件分析中藥指紋圖譜與藥效指標的相關(guān)性(譜效關(guān)系)，或在方劑配伍理論指導下選擇方劑中活性相同但機制不同的成分進行配伍，研究其協(xié)同作用[1]，但均尚未取得突破性進展。網(wǎng)絡(luò)藥理學是信息科學、醫(yī)學生命科學等多學科交叉的新學科方向[2]，可應用于闡釋中藥方劑主成分及配伍關(guān)系、篩選中藥活性成分、分析中藥藥效作用機制等多方面[3-4]。研究發(fā)揮某類功效的中成藥組方規(guī)律，不但可以探索組方用藥之間的關(guān)聯(lián)規(guī)則，而且可能發(fā)現(xiàn)潛在的藥物組合，有助于開發(fā)新藥以及加深理解其藥理作用[5]。此外，對復方中起效的單體、作用靶點、信號通路等進行預測及關(guān)聯(lián)[6]，也有助于理解藥效作用機制。

含有水蛭的經(jīng)方主要作用是活血化瘀，故這類方劑有共同的機制，又有各自特點，其用于治療腫瘤有較悠久歷史。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法對含有水蛭的抗腫瘤經(jīng)方的組方規(guī)律、核心配伍中藥以及水蛭的起效單體、作用靶點、信號通路等方面進行研究，為研究含水蛭的經(jīng)方抗腫瘤機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水蛭相關(guān)方劑的收集 TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)是整合了47 000個方劑、8 159味中藥以及它們包含的25 210個主要成分信息的數(shù)據(jù)庫[7]。從TCMID中下載數(shù)據(jù)，使用Excel篩選整理水蛭相關(guān)的方劑的方劑名稱、方劑組成、用藥方式所治疾病及出處，選取具有抗腫瘤作用的水蛭相關(guān)的方劑。

1.2 水蛭抗腫瘤經(jīng)方組方配伍網(wǎng)絡(luò)的繪制 將水蛭抗腫瘤方劑的藥物配伍信息，用Excel建立文本庫，導入Cytoscape 3.5.1軟件，繪制中草藥配伍的網(wǎng)絡(luò)圖，利用Degree算法篩選出現(xiàn)頻率前10位中草藥作為水蛭抗腫瘤經(jīng)方的核心中草藥。

1.3 配伍中草藥的化學成分分析及潛在靶蛋白的預測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[8]收集水蛭抗腫瘤經(jīng)方的核心中草藥及其化學成分，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30%、類藥性(druglikeness，DL)>0.18作為截斷值，篩選符合條件的化合物進行靶蛋白預測，利用Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建配伍中草藥的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，并利用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制配伍中草藥靶蛋白的重復情況。

1.4 配伍中草藥靶蛋白的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及通路富集分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)直接對配伍中草藥靶蛋白構(gòu)建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，并直接利用KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)[9]對靶蛋白進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集。通過Cytoscape 3.5.1軟件中的MCODE插件分析配伍中草藥靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，提取核心子集，再利用KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫對該子集蛋白進行KEGG通路富集分析。

1.5 水蛭素的靶蛋白預測及其PPI網(wǎng)絡(luò)圖、通路富集分析 水蛭素是水蛭發(fā)揮功效的主要成分[10]，在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中收集到其化合物結(jié)構(gòu)共21種，利用CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)[11]預測水蛭素的靶蛋白。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，使用KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 水蛭相關(guān)方劑出處與主要治療方向 基于TCMID數(shù)據(jù)庫，篩選出含有水蛭的口服方劑共106個，分別來自《圣惠》《普濟方》《千金》《圣濟總錄》等39部典籍，見圖1。水蛭相關(guān)的106個方劑分別應用于痛癥(27/106)、產(chǎn)后病(21/106)、閉經(jīng)(19/106)、外傷疼痛(17/106)、月經(jīng)不調(diào)(16/106)、腹腔腫瘤(10/106)、骨折(10/106)、麻風(3/106)、淋巴結(jié)核(2/106)、陰道出血(2/106)、疝氣(2/106)、心絞痛(1/106)、肝硬化(1/106)和瘡瘍膿腫(1/106)14種疾病。

圖1 水蛭相關(guān)方劑的出處

2.2 水蛭抗腫瘤經(jīng)方的組方配伍網(wǎng)絡(luò) 水蛭抗腫瘤方劑共10個，分別是摩挲丸、琥珀丸、桃仁丸、芫花散、通經(jīng)散、加味抵當丸、水蛭飲、化蠱丸、大黃(庶蟲)蟲丸、愈黃丹。共涉及41味中草藥，根據(jù)經(jīng)方里中草藥的配伍情況構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)，節(jié)點之間連線代表中草藥之間存在配伍關(guān)系。對藥物使用頻率前10位的中草藥依次為水蛭、虻蟲、大黃、桃仁、干漆、琥珀、牛膝、三棱、莪術(shù)、肉桂，其中水蛭、虻蟲、大黃、桃仁、干漆、琥珀、三棱、莪術(shù)均為活血化瘀藥。

圖2 水蛭抗腫瘤經(jīng)方的中草藥配伍網(wǎng)絡(luò)

2.3 配伍中草藥的分子-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)及其靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖 TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄有水蛭抗腫瘤經(jīng)方中的大黃、桃仁、三棱、莪術(shù)。以O(shè)B>30%且DL>0.18為篩選標準，與大黃有關(guān)的92個化合物中有16個符合標準，分別是大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷(emodin-1-O-β-D-glucopyranoside)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、決明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷[torachrysone-8-O-beta-D-(6′-oxayl)-glucoside]、胡蘿卜苷qt(Daucosterol_qt)、沒食子酸-3-O-(6′-O-鎵基)-葡萄糖苷[gallic acid-3-O-(6′-O-galloyl)-glucoside]、棕櫚苷A(palmidin A)、大黃素甲醚雙葡萄糖苷(physcion diglucoside)、β胡蘿卜素氧化物(mutatochrome)、番瀉苷D_qt(sennoside D_qt)、番瀉苷E_qt(Sennoside E_qt)、澤蘭黃醇素(eupatin)、原花青素B-5，3′-O-沒食子酸酯(procyanidin B-5，3′-O-gallate)、大黃酸(rhein)、(-)-兒茶素[(-)-catechin]、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、決明內(nèi)酯(toralactone)。與桃仁有關(guān)的66個化合物中有23個符合標準，分別是谷甾醇α1(sitosterol alpha1)、2，3-二脫水GA 70(2，3-didehydro GA70)、2，3-二脫水GA77(2，3-didehydro GA77)、GA119、GA120、GA121-異形內(nèi)酯(GA121-isolactone)、GA122、GA122-異黃酮(GA122-isolactone)、赤霉素 17(gibberellin 17)、4a-formyl-7alpha-hydroxy-1-methyl-8-methylidene-4aalpha，4bbeta-gibbane-1alpha，10beta-dicarboxylic acid、GA30、Gibberellin A44、GA54、GA60、GA63、gibberellin 7、GA77、GA87、3-O-p-coumaroylquinic acid、populoside_qt、hederagenin、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、菜油甾醇(campesterol)。與三棱有關(guān)的30個化合物中有4個符合標準，分別是反式性腺酸(trans-gondoic acid)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、芒柄花黃素(formononetin)、豆甾醇(Stigmasterol)。與莪術(shù)有關(guān)的81個化合物中有3個符合標準，分別是hederagenin、wenjine、二去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)。對這4味中藥篩選出的46個化合物和其靶標構(gòu)建分子-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖3。利用STRING數(shù)據(jù)庫對46個化合物對應的97個靶蛋白構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)，經(jīng)Cytoscape 3.5.1軟件處理后，節(jié)點顏色越暗，代表Degree值越小。

圖3 配伍中草藥的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 配伍藥靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 制配伍中草藥靶蛋白的重復情況及KEGG通路富集 利用VENNY 2.1繪制大黃、桃仁、三棱、莪術(shù)靶蛋白的文氏圖(見圖5)。其中，大黃、桃仁、三棱、莪術(shù)共有的靶蛋白有16個，分別是SCN5A、GABRA1、PTGS1、GABRA5、CYP2R1、CHRM2、PTGS2、CHRM3、CHRM1、PNRC2、PTGES3、IGHG1、PDE3A、GABRA2、ADRA1B、GABRA3。經(jīng)KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，16個靶蛋白主要富集于(hsa04080)神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路(P=3.99×10-14)，參與該通路的蛋白有GABRA1、GABRA2、GABRA3、GABRA5、CHRM1、CHRM2、CHRM3、ADRA1B。

圖5 大黃、桃仁、三棱、莪術(shù)靶蛋白的文氏圖

2.5 配伍中草藥靶蛋白核心子集的PPI網(wǎng)絡(luò)圖及富集分析 經(jīng)Cytoscape 3.5.1的MCODE插件分析配伍中草藥靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，獲得列其首位的核心子集(見圖6)，該子集得分=20.846，含有27個蛋白，分別是CASP3、PPARG、HSP90AA1、CDKN3、FLT1、MAPK14、JUN、CASP9、TGFB1、MYC、PIK3CG、BAX、IL4、CHEK1、TP53、BCL2、F2、NOS2、PCNA、CCNB1、CDK2、NOS3、CALM1、IL1B、TNF、PTGS2、CASP8。利用KOBAS 3.0對這27個蛋白進行KEGG通路富集分析，該蛋白子集主要富集于乙型肝炎病毒、癌癥通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、肺結(jié)核、結(jié)直腸癌、弓形體病、p53信號通路、利什曼病、細胞凋亡、小細胞肺癌、美洲錐蟲病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路、百日咳、鉑類藥物耐藥、人類T型細胞淋巴病毒(human T-cell lymphotropic virus，HTLV-Ⅰ)感染、非酒精性脂肪肝、病毒癌變、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路等，見圖7。

圖6 配伍中草藥核心子集靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 配伍中草藥核心子集靶蛋白的前20個KEGG通路富集

2.6 水蛭素的靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖及通路富集分析 利用CTD數(shù)據(jù)庫預測出水蛭素的靶蛋白10個，分別是F2、SERPINE1、MPO、PDGFB、CGB3、CRP、F2R、F2RL3、P2RY12、SELP。利用STRING數(shù)據(jù)庫對10個靶蛋白構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖8)。用KOBAS 3.0對這10個蛋白進行KEGG通路富集分析(見圖9)，該蛋白子集主要富集于補體和凝血級聯(lián)、血小板活化、Rap1信號通路、調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、癌癥途徑、磷脂酶D信號通路、PI3K/Akt信號通路等。

圖8 水蛭素靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 水蛭素靶蛋白的前8個KEGG通路富集

3 討 論

中藥多成分、多靶點、多層次的作用，使得其作用機制極其復雜。傳統(tǒng)的單體-效應-機制的西藥研究思路，忽視了中藥多成分協(xié)同作用特點，難以解釋中藥復方的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，以目前單體、化合物等微觀研究所獲得的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，從含水蛭抗腫瘤經(jīng)方的組方規(guī)律、核心配伍中藥以及水蛭的起效單體、作用靶點、信號通路等幾方面進行研究，推測它們之間的相互關(guān)系及可能機制，為研究含水蛭經(jīng)方抗腫瘤機制提供理論參考依據(jù)。

3.1 含水蛭經(jīng)方的出處、治療范圍及組方規(guī)律 腫瘤乃痼惡之疾，威脅著人類健康。早在《靈樞·刺節(jié)真篇》中就有“筋瘤”“腸瘤”“昔瘤”等記載。腫瘤被醫(yī)家歸屬為“癥瘕積聚”的范疇，主要治療手段有清熱解毒[12]、活血化瘀[13]、扶正培本[14]、益氣養(yǎng)陰[15]、軟堅散結(jié)[16]、以毒攻毒[17]等。水蛭，味咸、苦，性平，有毒，能破血逐瘀，通經(jīng)消癥，主要治療血瘀經(jīng)閉、癥瘕痞塊、跌打損傷，臨床上水蛭被用于治療食管癌、胃癌、腸癌、子宮癌、乳腺癌等腫瘤且具有較好的療效。本研究結(jié)果顯示，《圣惠》《普濟方》《千金》《圣濟總錄》等39部典籍有含水蛭的經(jīng)方106個，主要應用于痛癥、產(chǎn)后病、閉經(jīng)、外傷疼痛、月經(jīng)不調(diào)、腹腔腫瘤、骨折等14種疾病的治療，這反映其具有“破血逐瘀，通經(jīng)消癥”之功效。其中明確用于治療腫瘤相關(guān)疾病的方劑共10個，分別是摩挲丸、琥珀丸、桃仁丸、芫花散、通經(jīng)散、加味抵當丸、水蛭飲、化蠱丸、大黃(庶蟲)蟲丸、愈黃丹。共涉及41味中草藥，使用頻率前10位的中草藥依次為水蛭、虻蟲、大黃、桃仁、干漆、琥珀、牛膝、三棱、莪術(shù)、肉桂，其中，水蛭、虻蟲、大黃、桃仁、干漆、琥珀、三棱、莪術(shù)8味均為活血化瘀藥。由此可推測，中醫(yī)理論“活血化瘀”是含水蛭經(jīng)方抗腫瘤的主要方式，主要應用于“實癥”腫瘤患者。所有含水蛭的經(jīng)方均將水蛭與虻蟲聯(lián)用，因水蛭性緩，虻蟲性烈，聯(lián)用功效相得益彰。

3.2 含水蛭經(jīng)方主要配伍藥的有效分子、靶點及其相互關(guān)系 本研究篩選的方劑均為口服方劑，在人體代謝過程中需要經(jīng)過吸收、分布、代謝及排泄，因此以O(shè)B>30%且DL>0.18為篩選標準，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選水蛭經(jīng)方的主要配伍藥的有效分子及靶點，獲得大黃的有效分子16個、桃仁的有效分子23個、三棱的有效分子4個、莪術(shù)的有效分子3個，它們協(xié)同作用的靶蛋白共16個，主要參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用，因此考慮它們具有協(xié)同增強鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗驚厥作用[18]。大黃、桃仁、三棱、莪術(shù)有效成分的靶點主要參與乙型肝炎病毒、癌癥通路等，而中國是HBV感染的大國，由此說明水蛭配伍使用大黃、桃仁、三棱、莪術(shù)時，可影響炎癥和腫瘤的進程，進一步反映含水蛭抗腫瘤經(jīng)方的療效。

3.3 水蛭有效成分的主要靶點及其網(wǎng)絡(luò) 水蛭主要有效成分水蛭素的靶點主要參與補體和凝血級聯(lián)、血小板活化等通路，而腫瘤與血瘀密切相關(guān)，古有王清任《醫(yī)林改錯》曰“肚腹結(jié)塊,必有形之血”?，F(xiàn)代研究亦證實，惡性腫瘤患者普遍存在凝血異常，高凝狀態(tài)易并發(fā)血栓的形成[19]。由此推測水蛭通過抗凝血、抗血栓參與腫瘤的治療[20]。

此外，我們發(fā)現(xiàn)水蛭素和配伍中草藥存在共同的靶蛋白F2(即凝血因子Ⅱ)，F(xiàn)2在發(fā)育和出生后維持血管完整性方面發(fā)揮作用，其突變導致各種形式的血栓形成和異常血栓，可能為潛在靶點。配伍藥有效成分的靶點以及水蛭有效成分的靶點均參與PI3K/Akt信號通路。PI3K/Akt信號通路是細胞內(nèi)最重要的信號通路之一,在促進細胞生長、增殖，促進細胞運動、侵襲，抑制細胞凋亡，促進血管生成，抵抗化療并產(chǎn)生耐藥等方面起到重要的作用。因此含水蛭的抗腫瘤經(jīng)方可能同時具有協(xié)同抵抗耐藥作用。

綜上所述，含水蛭的抗腫瘤經(jīng)方作用機制是多成分、多靶點、多層次的，涉及46種有效成分、97個靶點以及乙肝病毒、癌癥通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、補體和凝血級聯(lián)、血小板活化等多條通路。因此我們推測這類方劑作用機制主要體現(xiàn)在以下方面：(1)水蛭抗血栓形成，從而改善腫瘤微環(huán)境；(2)以F2為潛在靶點促進血管正常化，抑制血管生成，促進良性血管增生，增加化療藥物的抗腫瘤效果，以利于腫瘤治療；(3)PI3K/Akt信號通路等通路抵抗化療及耐藥，從而增強抗腫瘤治療的效果。本研究或為研究水蛭經(jīng)方抗腫瘤機理提供了一個理論依據(jù)，也為中藥復方藥效物質(zhì)探索提供一個新的思路、方法。