UCH37與非小細胞肺癌患者預后的相關性研究

王川麗，王俊峰

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院 呼吸科，四川 瀘州 646000）

肺癌是全世界腫瘤相關死亡的主要的因素之一，其發(fā)病率及惡性程度高，目前尚缺少有效的治療手段。非小細胞肺癌占肺癌發(fā)病率的80%～85%，發(fā)病患者多為老年人，50%以上診斷為非小細胞肺癌的患者為70歲以上老年人，但近年來，有報道稱其發(fā)病趨于年輕化[1-3]。盡管目前科學家在肺癌的診斷及治療方面的研究取得顯著的成就，但肺癌患者的預后仍不樂觀。尤其是大部分非小細胞肺癌發(fā)病年齡大，身體狀況差，往往在就診時已處于晚期，腫瘤的死亡率、復發(fā)率極高[4-5]。因此，目前急需尋找非小細胞肺癌有效的早期診斷手段及治療靶點，以改善患者的生存及預后。

泛素化羧基末端水解酶37（ubiquitin carboxylterminal hydrolase 37,UCH37）是去泛素化酶家族成員。既往研究顯示，UCH37可以通過促進細胞中的一些原癌基因的表達及腫瘤干細胞樣特征在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[6-8]。比如在食管癌中，UCH37異常表達，并可以作為食管癌患者預后及復發(fā)的評判指標，其表達越高，患者手術后復發(fā)率越高，死亡率也越高[9]。然而，UCH37在非小細胞肺癌中的表達和臨床意義目前尚不清楚，需要進一步研究探索。

本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）檢測非小細胞肺癌及癌旁組織中UCH37的表達情況，分析UCH37的表達與非小細胞肺癌的臨床病理特征、患者生存預后的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2006年1月—2012年1月西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院呼吸科63例經(jīng)手術切除并病理診斷為非小細胞肺癌的患者的癌組織及癌旁組織標本，并完善其隨訪資料。術中將患者的癌及癌旁組織保存于液氮中備用。本研究已經(jīng)西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院倫理委員會批準，且入選本研究的患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取 步驟參照 RNA 提取試劑盒（購自Tiangen公司）中組織總RNA提取所述步驟：組織中加入適量裂解液，研磨充分后，向組織中加入勻漿液（含有590 μl去離子水、10 μl蛋白酶K），置于56℃孵箱中孵育 25 min，離心（12 000 r/min）8 min，取上清液，棄沉淀。加入無水乙醇（上清0.5倍體積），充分混勻后將其加入吸附柱，離心（12 000 r/min）30 s，棄上清液。向柱內(nèi)加入 RW1 液 350 μl，離心（12 000 r/min）30 s，棄廢液。向柱中加入 Dnase Ⅰ液（80 μl），室溫下靜置20 min。向柱中加入 RW1液（350 μl），離心（12 000 r/min）30 s，棄廢液。向柱中加入 RW 液（500 μl），離心（12 000 r/min）30 s，棄廢液。繼續(xù)離心（12 000 r/min）2 min，棄廢液。向柱加入去離子水（50 μl），室溫下靜置 3 min，離心（12 000 r/min）2.5 min，最終溶液為實驗用總RNA。

1.2.2 逆轉錄 Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（購自Tiangen公司），逆轉錄步驟如下：逆轉錄體系混合液 ：含 1 μl 10× RT Mix，1μl Oligo-（dT）15，1 μl dNTPs，1 μl RNA，1 μl Quant逆轉錄酶，5 μl去離子水?；靹蚝?7℃孵箱中靜置1 h。

1.2.3 qRT-PCR qRT-PCR 步驟參照 SYBR Green Ⅰ試劑盒（購自Tiangen公司），說明書操作。試劑A：20×SYBR 溶液 125 μl，2.5×Real Master Mix 1.0 ml充分混勻。20 μl反應體系：上述試劑A（9 μl）、正反向引物（各1 μl）、cDNA模板（2 μl）、去離子水（7 μl）混合均勻，鋪板置于PCR儀器中，設定反應條件為 ：95℃預變性 3 min，95℃變性 20 s，60℃退火 20 s，68℃延伸 20 s。共設置 30 個循環(huán)，循環(huán)結束后分析各分子相對表達水平。UCH37正向引物：5'-TGTCTCATGGAAAGCGACCC-3'，反向引物：5'-GC CACTTGAAAAGAAAAATTAACCC-3'；內(nèi)參β-actin正向引物：5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3' ，反向引物：5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3'。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較做Log-rankχ2檢驗；影響因素的分析采用Cox比例風險回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UCH37在非小細胞肺癌及癌旁組織中的表達情況

非小細胞癌組織中UCH37相對表達水平為（2.736±0.189），癌旁組織中UCH37的相對表達水平為（0.889±0.091），非小細胞肺癌中的UCH37表達高于癌旁組織（t=8.841，P=0.007）。見圖1。

2.2 UCH37與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系

圖1 非小細胞肺癌及癌旁組織中UCH37 mRNA的表達水平

根據(jù)以上結果中UCH37在非小細胞肺癌中的相對表達水平，利用X-tile軟件確定最佳分界點3.014。將非小細胞肺癌患者分為兩組：高于此值的為UCH37高表達組，低于此值的為UCH37低表達組。結果顯示，UCH37表達與腫瘤分期（P=0.034）、淋巴結轉移（P=0.017）相關，UCH37低表達組患者腫瘤分期及淋巴結轉移情況均優(yōu)于UCH37高表達組；而與年齡、性別等特征無相關性。見表1。

2.3 UCH37與非小細胞肺癌患者術后生存的關系

根據(jù)UCH37表達將非小細胞肺癌患者分為兩組：UCH37高表達組、UCH37低表達組。UCH37低表達組的生存率（χ2=7.327，P=0.009）及無進展生存率（χ2=3.153，P=0.032）均高于UCH37高表達組。見圖2。

2.4 UCH37與非小細胞肺癌患者預后的關系

利用Cox風險比例模型評估UCH37表達及其他臨床病理特征對非小細胞肺癌患者生存的影響。單因素分析示，臨床分期（風險比Hazard ratio,）=5.019，P=0.009）、淋巴結轉移情況（，P=0.021）及 UCH37的表達（）與總體生存期相關（見表2）。選擇單因素分析有統(tǒng)計學意義的變量進入多因素Cox比例風險回歸模型分析（采用變量篩選，逐步回歸法），引入水準α=0.05，剔除水準α=0.10，結果示：TNM分期（）、淋巴結轉移情況（）及UCH37表達（）可以作為非小細胞肺癌患者判斷預后的指標。見表3。

表1 UCH37與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系

圖2 UCH37與非小細胞肺癌患者術后生存期的關系

表2 影響非小細胞肺癌患者生存的單因素及參數(shù)估計

表3 影響非小細胞肺癌患者生存的多因素及參數(shù)估計

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，UCH37在非小細胞肺癌組織中表達增高。并且UCH37與非小細胞肺癌患者TNM分期及遠處轉移相關。此外，UCH37的表達越高，非小細胞肺癌患者的總體生存率、無進展生存率及預后越差。以上結果提示，在非小細胞肺癌中UCH37發(fā)揮著癌基因的作用，其異常表達對非小細胞肺癌的發(fā)生及進展均有促進作用。

泛素是一種高度保守的小分子蛋白，可以通過泛素-蛋白酶體降解途徑選擇性的降解蛋白發(fā)揮生物學功能，而這一途徑是真核生物內(nèi)重要的非溶酶體途徑。研究顯示，蛋白的泛素化調節(jié)是一種可逆的生物過程。細胞中還有多種去泛素化酶，這些酶可水解底物蛋白上的泛素末端多肽鏈接，從而反向調節(jié)蛋白降解。蛋白的泛素化及去泛素化調節(jié)機制在細胞的多種生理過程包括基因的轉錄調控、細胞的增殖分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均有重要作用。細胞中存在5種去泛素化酶，其中以泛素羧基末端水解酶家族及泛素特異性加工酶家族為主。

UCH37是泛素羧基末端水解酶家族成員之一，可以通過拆分蛋白遠端的多聚亞基來抑制蛋白質降解。已經(jīng)證明UCH37可被Rpn13活化并摻入到19S復合物中，并可協(xié)助小鼠的心理發(fā)育，在腫瘤發(fā)生、侵襲和遷移中起重要作用[10]。UCH37可與Smad泛素化調節(jié)因子2競爭結合Smad7，阻止兩者形成復合物，抑制I型TGF-β泛素化，使后者蛋白表達上調[11]。此外，有研究報道UCH37的表達下調后，Caspase-9及Caspase-3進而活化，從而導致非小細胞肺癌細胞凋亡增加。WANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，UCH37在卵巢癌中異常高表達，其高表達預示著患者預后不良及腫瘤復發(fā)，與腫瘤的進展相關，UCH37可成為協(xié)助臨床醫(yī)生判斷卵巢癌切除手術的指標。CHEN等研究顯示UCH37在食管癌癌組織中的表達高于非腫瘤組織蛋白水平，在復發(fā)患者腫瘤組織中表達更高。UCH37表達與腫瘤的分期及淋巴結轉移相關，UCH37是患者總生存和無病生存的重要預測因子，并可作為腫瘤復發(fā)的預后指標。另有研究發(fā)現(xiàn)[9]，UCH37不參與Tcf7蛋白穩(wěn)定性的調節(jié)，但是在非洲爪蟾胚胎和人肝癌細胞中Tcf7與靶基因啟動子的結合中UCH37是必需的，UCH37是非洲爪蟾中Wnt/β-catenin途徑中穩(wěn)定β-catenin的正調節(jié)因子。本研究為Tcf7的染色質占有提供新機制，揭示UCH37在早期脊椎動物發(fā)育過程中的生理學意義[13]。本研究顯示，UCH37在腫瘤及生物進化過程中發(fā)揮的重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，UCH37在非小細胞肺癌中具有促癌作用。UCH37可以作為非小細胞肺癌判斷預后的分子指標。