鮮味肽與鮮味受體的研究進展

王莉，伍圓明，孫偉峰，車振明，丁文武*

(1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039；2.衡陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院， 湖南 衡陽 421008)

鮮味作為五種基本味覺之一，可以給人帶來愉悅感，代表了大部分氨基酸、核苷酸類營養(yǎng)物質(zhì)的特征風(fēng)味[1]，是人體必不可少的味覺需求。鮮味肽作為近年來提出的一種新型鮮味物質(zhì)，可通過與人體味蕾上的鮮味受體發(fā)生相互作用而呈現(xiàn)出一定的鮮味特征[2]，且可在不影響食品其他味感的基礎(chǔ)上，通過協(xié)同作用或美拉德反應(yīng)，補充或增強食品的原有風(fēng)味[3-5]。它不僅能帶來愉悅的味覺感受，還能提供肽及氨基酸類營養(yǎng)成分，在食品調(diào)味品領(lǐng)域的應(yīng)用中具有極大的發(fā)展前景。目前，已在鮮味肽提取、序列鑒定、序列特征分析以及鮮味受體呈味機制分析等方面取得了一定的進展[6,7]。本文主要對鮮味肽的來源、序列結(jié)構(gòu)特征、微生物生產(chǎn)和鮮味受體的種類、鮮味信號傳導(dǎo)及其識別機制進行了綜述，并結(jié)合當(dāng)前研究中存在的問題進行分析，以期對鮮味肽的挖掘、改造、應(yīng)用以及鮮味受體對鮮味肽的具體識別機制等研究提供參考。

1 鮮味肽的序列來源及其結(jié)構(gòu)特征

1.1 鮮味肽的序列來源

鮮味肽作為繼谷氨酸鈉(monosodium glutamate，MSG)、鳥苷酸(guanosine monophosphate，GMP)和肌苷酸(inosine monophosphate，IMP)之后的一種理想的天然鮮味物質(zhì)，是近年來鮮味調(diào)味劑領(lǐng)域的研究焦點。在早期研究中，鮮味肽的呈味描述形式各不相同，在1972年，Arai等[8]首次在大豆蛋白中提取出4條谷氨酰寡肽，被描述為具有肉湯味；在1975年，Noguchi等[9]在魚肉蛋白中提取出一系列呈味多肽，具有類似MSG的味道；在1978年，日本學(xué)者Yamasaki又從牛肉的木瓜蛋白酶水解液中分離、提取、純化出一種美味的多肽——牛肉八肽(beefy meaty peptide，BMP)，其氨基酸序列為Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala[10]，且閾值為1.41 mmol/L，稍低于MSG(1.56 mmol/L)[11]。隨后，逐漸在肉類酶解物、小麥面筋、火腿、花生、水產(chǎn)品等[12-16]富含蛋白質(zhì)的食物中也提取出一系列具有鮮味的多肽，同時，一些合成的肽也被報道具有鮮味[17]。此外，已有研究表明部分肽組分本身不具有風(fēng)味，但當(dāng)與其他鮮味成分共同存在時可引起風(fēng)味增強效果，如Glu-Glu，Glu-Val，Ala-Asp-Glu，Ala-Glu-Asp，Asp-Glu-Glu和Ser-Pro-Glu等一系列短肽組分均可以使鮮味顯著增強。近年來，對于新型鮮味肽的探索仍在繼續(xù)，依次從白腐乳、茶褐牛肝菌和蠶蛹水解物中提取出鮮味肽，并經(jīng)合成驗證，其中部分鮮味肽還具有鮮味增強作用[18-20]。目前已報道的大部分鮮味肽的序列、來源和呈味信息見表1。

表1 鮮味肽的序列來源和呈味信息Table 1 The sequence source and taste information of umami peptides

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

1.2 鮮味肽構(gòu)效關(guān)系

1.2.1 鮮味肽的肽鏈長度對其呈鮮效果的影響

肽鏈的長度與鮮味肽的鮮味密切相關(guān)。研究表明，引起鮮味的肽組分通常是小分子量肽[40]，鮮味肽氨基酸骨架一般結(jié)構(gòu)式為-O)(C)n(O-，n介于3～9之間，且當(dāng)n取值為4～6之間時鮮味最強，這意味著鮮味肽通常為具有3～9個碳原子的脂鏈，C原子可以被替換為O，N，S，P[41]。王麗華等在谷朊粉鮮味肽的呈味規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn)，分子量<1000 u的肽鮮味較強[42]；Ogasawara等[43]通過水解大豆蛋白發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量在1000～5000 u之間的肽段經(jīng)美拉德反應(yīng)后具有鮮味或鮮味增強的呈味特性。此外，Rhyu等[44]對韓國豆醬水提物的分級研究也表明，分子質(zhì)量在500～1000 u的短肽鮮味最強，對增強豆醬的風(fēng)味起決定性作用。總體而言，鮮味肽的肽鏈長度在一定程度上影響著其鮮味強度。

1.2.2 鮮味肽的氨基酸組成對其呈鮮效果的影響

鮮味肽的氨基酸組成直接影響著其呈味效果。據(jù)報道，鮮味肽序列中通常含有Glu和Asn酸性基團的1種或2種[45]，或是含有一定的親水性氨基酸殘基Tyr，Gly，Thr，Phe，Asp等[46]，且在堿性氨基酸和酸性氨基酸共同存在的情況下鮮味肽方可呈現(xiàn)出鮮味。此外，部分疏水性基團對鮮味肽的呈味效果也具有一定的影響，Yamasaki等[47]對BMP的序列結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala中的疏水性基團-Ser-Leu-Ala呈苦味，而BMP整體呈現(xiàn)鮮味，這可能是肽鏈向N端增長降低了疏水基團的疏水性；另一項相關(guān)研究也表明鮮味肽中存在的部分疏水氨基酸對其呈鮮具有重要貢獻[48]。

1.2.3 鮮味肽的氨基酸排列位置對其呈鮮效果的影響

各氨基酸的排列位置也會直接影響鮮味肽的呈味，但不同肽鏈長度的鮮味肽，其呈味結(jié)構(gòu)特征存在一定的差異。對于鮮味二肽，Tamura等關(guān)于酸性基團和堿性基團的位置對鮮味的影響研究發(fā)現(xiàn)，N-端為酸性氨基酸、C-端為堿性氨基酸的二肽具有呈味特性，而相反的結(jié)構(gòu)則不具有呈味特性，如Glu-Lys呈現(xiàn)鮮味而Lys-Glu無鮮味。Arai等對12種含有谷氨酸殘基的合成二肽的研究也證實了上述觀點，N端為谷氨酸，C端為疏水性較小的氨基酸時具有肉湯鮮味，如Glu-Asp，Glu-Thr，Glu-Ser和Glu-Glu。而對主鏈較長的鮮味多肽而言，呈現(xiàn)出相悖的規(guī)律。從Yamasaki等對BMP的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其N-端為帶正電的堿性基團Lys-Gly-，帶負(fù)電的酸性基團-Asp-Glu-Glu-緊鄰其C-端位置，而疏水性基團-Ser-Leu-Ala位于C端，它們的協(xié)同作用使得牛肉辛肽產(chǎn)生了鮮味?？傮w而言，鮮味肽分子必須具有帶正電、帶負(fù)電和疏水性基團，且3種分子團能分別置于鮮味受體的相應(yīng)位置并被識別，才能令人感受到較強烈的鮮味。

2 鮮味肽的微生物生產(chǎn)

在探索新型鮮味肽序列的同時，其生產(chǎn)應(yīng)用研究也取得了一定的進展。鮮味肽可以通過酶解提取、化學(xué)合成和微生物表達(dá)獲得，在這3種獲得方式中，微生物表達(dá)無疑是最具工業(yè)應(yīng)用前景的一種鮮味肽生產(chǎn)方式。早在2010年，王艷萍等學(xué)者就在畢赤酵母中以串聯(lián)的方式成功表達(dá)了多拷貝BMP，并探索了其發(fā)酵控制條件，最終BMP產(chǎn)量達(dá)到142.42 mg/L[49,50]。隨后，錢偉也在大腸桿菌中同樣采用串聯(lián)策略成功表達(dá)了3種鮮味二肽[51]。為了探索適合于鮮味肽單體的表達(dá)方式，張崟實驗室近年來研究了在BMP的C-端引入硫氧還蛋白于微生物大腸桿菌中表達(dá)后再將硫氧還蛋白去除獲得BMP的表達(dá)方式，最后成功表達(dá)帶標(biāo)簽的BMP融合蛋白，并在該融合蛋白的斷裂純化技術(shù)上取得了一定的進展，最終獲得BMP單體的純度最高達(dá)到98%[52-54]。上述關(guān)于鮮味肽微生物表達(dá)的探索對鮮味肽及其他呈味肽的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定基礎(chǔ)。

3 鮮味受體

鮮味是由鮮味物質(zhì)和位于味蕾中的鮮味受體之間的相互作用引起的，并且通過受體細(xì)胞的次級信使觸發(fā)的級聯(lián)信號傳遞而被大腦感知[55]，因此，鮮味受體是感知鮮味的關(guān)鍵。目前確定了2種主要的候選鮮味受體：異源二聚體T1R1/T1R3(taste receptor type 1 member 1/3)與味型代謝性谷氨酸受體mGluR4(taste-metabotropic glutamate receptor 4)，兩者都是C型G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors，GPCR)，由N末端捕蠅草結(jié)構(gòu)域(VFTD)、胞外富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)和七跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)組成，其中VFTD主要負(fù)責(zé)與鮮味配體識別。

3.1 異源二聚體T1R1/T1R3

隨著苦味受體T2Rs和甜味受體異源二聚體T1R2/T1R3相繼被鑒定[56，57]，異源二聚體T1R1/T1R3(見圖1中A)被鑒定為氨基酸受體，能對20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的大部分產(chǎn)生響應(yīng)[58]。Grace等人在添加鈉離子通道阻滯劑阿米洛利以去除鈉離子影響的前提下，分別敲除T1R1，T1R2，T1R3亞基，發(fā)現(xiàn)亞基T1R1和T1R3同時存在時才能對谷氨酸鈉、絲氨酸、L-AP4等多種鮮味物質(zhì)的刺激產(chǎn)生響應(yīng)，并且在核苷酸的存在下鮮味響應(yīng)顯著增強，因此，T1R1/T1R3被確定為鮮味受體的最佳候選[59]。

3.2 味型mGluR4

mGluR4最初發(fā)現(xiàn)于大腦中(腦型mGluR4)，隨后的研究表明mGluR4在舌的輪廓乳頭和葉狀乳頭的味覺受體細(xì)胞中也有表達(dá)(味型mGluR4)[60]，但味型mGluR4是腦型mGluR4的截斷形式，其胞外N末端氨基酸序列長度比腦型的短約50%(見圖1中B)[61]。味型mGluR4主要由MSG及其某些類似物激活，未報道對核苷酸敏感。Nirupa等人通過RT-PCR、原位雜交等手段發(fā)現(xiàn)味型mGluR4能響應(yīng)MSG類似物L(fēng)-AP4的刺激，并將其作為鮮味受體的候選之一。目前關(guān)于味型mGluR4的生理作用究竟是識別鮮味物質(zhì)還是參與鮮味信號傳導(dǎo)還未達(dá)成共識[62]，因此，還需更多證據(jù)來闡述味型mGluR4在鮮味感知中的具體功能。

圖1 鮮味受體及鮮味信號傳導(dǎo)示意圖Fig.1 Schematic diagram of umami receptor and umami signal transduction

4 T1R1/T1R3受體的鮮味識別機制

鮮味肽與鮮味受體相互作用是研究鮮味肽呈味特征、總結(jié)其呈味規(guī)律的有效途徑，但對于鮮味肽的具體識別機制當(dāng)前并沒有定論，且目前關(guān)于鮮味配體與鮮味受體T1R1/T1R3相互作用的研究主要基于小分子鮮味物質(zhì)。

5 鮮味信號傳導(dǎo)途徑

鮮味受體T1R1/T1R3能感知大多數(shù)鮮味物質(zhì)，包括氨基酸、肽和核苷酸等[68]，其鮮味傳導(dǎo)主要由Gβγ介導(dǎo)(見圖1中C)。鮮味物質(zhì)與受體結(jié)合激活Gβ3γ13，導(dǎo)致磷脂酶Cβ2(PLCβ2)被活化并將膜脂PIP2轉(zhuǎn)化為二?；视?DAG)和1,4,5-肌醇三磷酸(IP3)，IP3與III型IP3受體(IP3R3)結(jié)合，使Ca2+從離子庫中釋放到細(xì)胞內(nèi)，從而激活Ca2+依賴性陽離子通道TRPM5，而激活的TRPM5會使味覺細(xì)胞去極化，進一步激活電壓門控Na+通道并通過鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白1(CALHM1)[69,70]釋放ATP至味覺細(xì)胞外，隨后ATP信號傳入味覺神經(jīng)纖維上的離子型嘌呤受體，并通過級聯(lián)信號傳遞被大腦感知味覺[71]。值得注意的是，在蕈狀味蕾和腭味蕾中T1R1/T1R3的鮮味信號傳導(dǎo)由Gα介導(dǎo)[72]。

對于味型mGluR4，其鮮味主要由Gα介導(dǎo)(見圖1中C)。L-谷氨酸與受體結(jié)合激活Gα，進而活化磷酸二酯酶(PDE)，使胞質(zhì)內(nèi)cAMP濃度降低，從而解除了環(huán)核苷酸(cNMP)對Ca2+離子通道的抑制作用，使Ca2+從離子庫中順利釋放到胞內(nèi)，進一步導(dǎo)致味覺細(xì)胞膜去極化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放[73]，后續(xù)的信號傳導(dǎo)與T1R1/T1R3的一致。

在Gβγ介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑中，多項研究已證明由TRPM5通道引起的神經(jīng)遞質(zhì)ATP的釋放與味覺刺激引起的動作電位的頻率成比例[74,75]，因此該信號傳導(dǎo)途徑受到大部分學(xué)者認(rèn)可，也一定程度證明了T1R1/T1R3是鮮味受體的最佳候選。在Gα介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑中，cAMP在該信號傳導(dǎo)中的具體作用尚不清楚，并且其解除cNMP對離子通道的抑制作用也只是一種假設(shè)[76]。另外兩項在其他組織中關(guān)于PLCβ2和IP3R3生理功能的研究表明兩者通過cAMP依賴性磷酸化可降低胞內(nèi)Ca2+的釋放[77，78]，因此，Sue認(rèn)為在Gα介導(dǎo)的鮮味信號傳導(dǎo)中cAMP的功能更可能調(diào)節(jié)Ca2+信號的釋放，而不是激活Ca2+的釋放。Clapp則詳細(xì)地指出cAMP通過調(diào)節(jié)cAMP依賴性蛋白激酶A的活性可增強或抑制Ca2+的釋放[79]?？偟膩碚f，對鮮味信號傳導(dǎo)還需進一步的研究以加深對鮮味受體多樣性及鮮味信號感知的理解。

6 展望

最近幾年，為了加速鮮味肽的應(yīng)用研究，學(xué)者們逐步對鮮味肽復(fù)合基料的酶解工藝及其美拉德反應(yīng)等應(yīng)用方面進行了一定的探索。鮮味通常與其他味感之間具有協(xié)同作用，故鮮味肽的應(yīng)用并不需執(zhí)著于提取單個鮮味肽，而可利用酶水解法制作復(fù)合的鮮味肽基料，直接作為鮮味調(diào)味料應(yīng)用于食品中[80,81]。如劉通訊等直接將大豆復(fù)合呈味肽應(yīng)用于醬油中的研究，提升了醬油的鮮味協(xié)調(diào)性[82]；周超等人也直接研究了茶褐牛肝菌的酶解工藝，制作獲得了鮮味突出，并含豐富呈味肽的復(fù)合基料[83]。這些研究為鮮味肽的具體應(yīng)用提供了一定的參考，鮮味肽與其他呈味劑之間的復(fù)配應(yīng)用可能是今后研究的主體方向。

當(dāng)前，關(guān)于鮮味肽一級氨基酸序列的探究仍在繼續(xù)，但新型鮮味肽的研究進度受到了限制，利用鮮味受體制備生物傳感器檢測鮮味物質(zhì)的發(fā)展為鮮味肽的識別鑒定提供了一個高效快速的檢測方式[84-86]。同時，在鮮味肽的結(jié)構(gòu)特征方面，目前的研究側(cè)重于其氨基酸性質(zhì)和二級序列的初步分析上，對于鮮味肽三級結(jié)構(gòu)上的呈味特征尚未完全定論。此外，對于鮮味肽與鮮味受體分子水平上的相互作用分析等研究也較少，且鮮味受體對不同鮮味物質(zhì)的識別位點也各不相同，例如，鮮味受體識別L-Glu的關(guān)鍵殘基為：Thr-149，Ser-172，Asp-192，Tyr-220和Glu-301，而識別IMP的關(guān)鍵殘基為：His-71，Arg-277，Ser-306和His-308[87]。因此，需結(jié)合鮮味受體和鮮味肽的相互作用關(guān)鍵位點的分析，加深受體對鮮味肽識別機制的理解，并在此基礎(chǔ)上有目的地改造、設(shè)計或合成新型鮮味肽，以期獲得呈鮮效果更好的鮮味肽序列。