新型啤酒穩(wěn)定劑對啤酒蛋白質(zhì)吸附特性的研究

唐棟健，鄭飛云，馬軍濤，成 貴，朱林江，李永仙*，李 崎

（1.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.溧陽市鴻智新材料科技有限公司，江蘇 常州213000）

引起啤酒非生物渾濁的因素主要有蛋白質(zhì)—多酚渾濁、葡聚糖糊精渾濁、酒花樹脂渾濁以及草酸鈣結(jié)晶沉淀等，其中大部分混濁來自于蛋白質(zhì)—多酚混濁[1]。通過氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，啤酒混濁蛋白脯氨酸含量較高，且蛋白質(zhì)所含脯氨酸摩爾含量越高越容易形成混濁物質(zhì)[2]。啤酒生產(chǎn)過程除了嚴(yán)格控制生產(chǎn)工藝和原料外，還經(jīng)常添加非生物穩(wěn)定劑來控制啤酒混濁。目前市場上廣泛使用的穩(wěn)定劑有PVPP、硅膠、單寧酸等，這些穩(wěn)定劑可除去啤酒中的混濁活性蛋白質(zhì)或混濁活性多酚[3]。作者所用新型啤酒穩(wěn)定劑（BFSA）系基于特殊處理的硅藻土，但其吸附特性和作用機(jī)理尚不完全明確。

通過對BFSA吸附的啤酒蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸分析以及對BFSA吸附蛋白質(zhì)過程進(jìn)行吸附等溫線、吸附動力學(xué)和吸附熱力學(xué)分析，初步探究了BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；凱氏定氮儀：瑞士FOSS公司產(chǎn)品；真空抽濾機(jī)：VACUUBRAND公司產(chǎn)品；NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀：美國尼高力儀器公司產(chǎn)品；安捷倫液相色譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品。

作者使用的新型啤酒穩(wěn)定劑BFSA化學(xué)成分（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：SiO2（90.42%）、Al2O3（1.95%）、Fe2O3（1.33%）、其他（6.3%）。

1.2 研究方法

1.2.1 紅外光譜分析 取少量BFSA與KBr混合研磨粉碎，壓片后樣品放入傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行FT-IR分析。

1.2.2 振蕩吸附實(shí)驗(yàn) 100 mL已知蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的除氣啤酒中加入0.05 g BFSA，置于振蕩水浴鍋中， 振蕩速度 150 r/min，5、15、25、35 ℃下振蕩15、30、45、60、75、90 min 后取樣， 真空抽濾機(jī)抽濾后消化并使用凱氏定氮儀測定其吸附容量。

1.2.3 啤酒蛋白質(zhì)濃度測試方法

取5 mL除氣啤酒，放入消化管加4～5滴濃硫酸220℃消化100 min，然后加5 g定氮催化劑和12 mL濃硫酸420℃消化100 min并使用凱氏定氮儀測定啤酒蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.2.4 BFSA吸附蛋白質(zhì)氨基酸分析 600 mL已知蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的除氣啤酒中加入0.3 g BFSA，20℃振蕩吸附1 h，干燥后稱取一定質(zhì)量的BFSA，HCl水解后用氨基酸分析儀測定BFSA吸附蛋白質(zhì)的氨基酸組成。

1.2.5 吸附等溫線、動力學(xué)、熱力學(xué)的數(shù)據(jù)收集實(shí)驗(yàn)方法 采用1.2.2振蕩吸附實(shí)驗(yàn)，測定啤酒初始蛋白濃度對BFSA吸附的影響，此數(shù)據(jù)用于吸附等溫線分析；測定吸附時(shí)間和吸附溫度對BFSA吸附的影響，此數(shù)據(jù)用于吸附動力學(xué)分析和吸附熱力學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 BFSA紅外光譜分析

圖1為BFSA的紅外光譜圖，在3 428 cm-1附近存在OH伸縮振動，1 093 cm-1附近存在Si-O反對稱伸縮振動，793 cm-1附近存在Si-O對稱伸縮振動，467 cm-1附近存在Si-O-Si反對稱彎曲振動[4]，以上數(shù)據(jù)尤其是OH伸縮振動明確了BFSA中羥基的存在，對氫鍵作用的可能性提供了基礎(chǔ)。

2.2 BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)的氨基酸分析

由于啤酒混濁蛋白質(zhì)富含脯氨酸[2]，因此可通過對BFSA所吸附的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸分析來評價(jià)其對混濁敏感蛋白質(zhì)的吸附專一性。脯氨酸含量的越高，說明BFSA對混濁敏感蛋白質(zhì)的吸附專一性就越高。如圖2所示，啤酒中蛋白質(zhì)脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.53%，而BFSA吸附蛋白質(zhì)的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至9.71%，表明BFSA對啤酒混濁敏感蛋白有較好的吸附選擇性。

圖1 BFSA紅外光譜圖Fig.1 FT-IR of BFSA

圖2 BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)的氨基酸分析Fig.2 Amino acid of beer protein adsorbed with BFSA

2.3 BFSA吸附影響因素分析

2.3.1 吸附時(shí)間和溫度對BFSA吸附的影響 在啤酒蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 980 mg/L，吸附劑用量0.5 g/L，體系pH為4.3的條件下，考察吸附時(shí)間和溫度對BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)的影響。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)吸附時(shí)間小于1 h時(shí)，BFSA的吸附容量隨著時(shí)間的增加而增加，當(dāng)吸附時(shí)間大于1 h時(shí)，BFSA的吸附容量幾乎無變化，該吸附過程在1 h作用達(dá)到平衡。

2.3.2 啤酒蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對BFSA吸附的影響吸附劑用量為0.5 g/L，體系pH為4.3，吸附時(shí)間為1 h，吸附溫度為20℃條件下，分別將蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為 5 525 mg/L 的啤酒稀釋 20、10、5、2.5、1.25 倍，得到蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為 276.25、552.5、1 105、2 210、4 420、5 525 mg/L，并加入少量酸調(diào)節(jié)使溶液pH不變，考察初始啤酒蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對BFSA吸附容量的影響。結(jié)果如圖4所示，BFSA吸附容量隨著質(zhì)量濃度的增加而升高，在啤酒蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度較小的情況下，BFSA吸附容量迅速增加，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度上升到一定濃度后，BFSA吸附容量增加緩慢。

圖3 吸附時(shí)間和吸附溫度對BFSA吸附的影響Fig.3 Effect of adsorption time and temperature on BFSA

圖4 啤酒蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對BFSA吸附的影響Fig.4 Effect of beer protein concentration on BFSA

2.4 BFSA吸附機(jī)理探究

2.4.1 吸附等溫線分析 圖5為BFSA對啤酒蛋白質(zhì)的平衡吸附等溫線，采用式（1）和式（2）對2.3.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合得到的等溫線參數(shù)經(jīng)計(jì)算后列于表1中[5-6]：

式中，Qe為平衡吸附量 （mg/g）；Qm為飽和吸附量（mg/g）；Ce為吸附后啤酒蛋白質(zhì)溶液的平衡質(zhì)量濃度 （mg/L）；b為 Langmuir 吸附常數(shù) （L/g）；KF為Freundlich 吸附常數(shù)（mg/g）·（L/mg）1/n；n為Freundlich吸附常數(shù)，無因次。

圖5 BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)的吸附等溫線Fig.5 Adsorption isotherm of beer protein on BFSA

對比2種吸附等溫線方程的相關(guān)系數(shù)R2，F(xiàn)reundlich方程更符合BFSA對啤酒蛋白質(zhì)吸附過程，說明吸附過程更接近于多分子層吸附理論。Freundlich吸附方程式中1/n＜1時(shí)吸附比較容易進(jìn)行，1/n＞1 時(shí)則表明吸附困難[7]。

BFSA對啤酒蛋白質(zhì)的吸附容量可由Langmuir等溫線模型中的單層飽和吸附量Qm值表示。由Langmuir參數(shù)可知，20℃時(shí)BFSA對啤酒蛋白質(zhì)的平衡吸附量為71.40 mg/g。另一個(gè)重要參數(shù)-吸附平衡參數(shù)RL由式（3）計(jì)算得到：

式中：b為Langmuir常數(shù)；C0為啤酒初始蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/g）；RL為無因次參數(shù)，RL=0表明吸附不可逆；0＜RL＜1表明吸附有利于向吸附方向進(jìn)行，RL越小越有利于吸附的進(jìn)行[8]；RL=1表明吸附處于一個(gè)線性平衡狀態(tài)；RL＞1表明吸附有利于向解析方向進(jìn)行。

圖6表明，隨著啤酒蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度的升高，RL在逐漸降低，說明啤酒蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度越高越有利于吸附的進(jìn)行。

2.4.2 吸附動力學(xué)分析 研究了不同溫度和時(shí)間對BFSA吸附的影響，吸附初始時(shí)BFSA對蛋白的吸附速率很快，隨著時(shí)間增加吸附速率開始減小，這可能是因?yàn)槲匠跗贐FSA表面的空余吸附位點(diǎn)較多且啤酒溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度比BFSA表面大，因此吸附初期速率較快。隨著吸附的進(jìn)行，BFSA表面活性位點(diǎn)逐漸減少，導(dǎo)致吸附速率開始降低[9-13]。 采用式（4）和式（5）擬合圖 7數(shù)據(jù)，擬合曲線如圖7所示，計(jì)算得到的準(zhǔn)一級、二級動力學(xué)參數(shù)如表2所示：

圖6 RL與C0的關(guān)系曲線Fig.6 Curve of RLand C0

式中：Qt為t時(shí)刻吸附量 （mg/g）；Qe為平衡吸附量（mg/g）；K1為一級動力學(xué)速率常數(shù) （min-1）；K2為二級動力學(xué)速率常數(shù)（g/（mg·min））。

圖7 不同溫度下BFSA對啤酒蛋白質(zhì)的準(zhǔn)一級、準(zhǔn)二級動力學(xué)方程擬合Fig.7 Fitting the adsorption kinetics curve of beer protein on BFSA by two models in different temperatures

由表1中模型相關(guān)系數(shù)R2可以看出，準(zhǔn)二級動力學(xué)方程R2值更高，因此實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)更加符合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程。

2.4.3 吸附熱力學(xué)分析 由于BFSA吸附過程更符合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程，所以根據(jù)式（6）Arrhenius公式所作的lnK2～1/T關(guān)系圖，以lnK2為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)，直線回歸后所得到的斜率就是-E/R，如圖8所示，因此可以計(jì)算得到BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)的活化能，計(jì)算結(jié)果見表3對吸附而言，物理吸附活化能較低E值在5～40 kJ/mol左右，化學(xué)吸附的活化能較高在40～800 kJ/mol左右。如表4所示，BFSA對啤酒蛋白質(zhì)的吸附的E值為26.28 kJ/mol，說明吸附過程是物理吸附[15]。

式中：K為二級動力學(xué)速率常數(shù)；K0為指前因子；E為BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)活化能（kJ/mol）；R為摩爾氣體常數(shù)（8.314J/（mol·K））；T為啤酒溶液溫度（K）。

表1 BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)動力學(xué)參數(shù)Table 1 Adsorption kinetics parameters of beer protein on BFSA

圖8 BFSA對啤酒蛋白質(zhì)吸附的lnK2～1/T關(guān)系圖Fig.8 lnK2～1/T plots for adsorption of beer protein on BFSA

通過計(jì)算吸附自由能（ΔG），焓變（ΔH）和熵變（ΔS）研究啤酒蛋白質(zhì)在BFSA表面的吸附熱力學(xué)，3個(gè)熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系如式下：

式中：qT為在t時(shí)刻BFSA對啤酒蛋白質(zhì)的吸附量（mg/g）；CT為在t時(shí)刻啤酒蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（mg/L）；ΔS為熵變 （J/mol·K）；ΔH為焓變（kJ/mol）；ΔG為吉布斯自由能（kJ/mol）。

圖9 BFSA對啤酒蛋白質(zhì)吸附的lg（qT/CT）～1/T關(guān)系圖Fig.9 lg （qT/CT）～1/T plots for adsorption of beer protein on BFSA

圖9 是根據(jù)式（7）所作的BFSA對啤酒蛋白質(zhì)吸附的 lg（qT/CT）～1/T關(guān)系圖，lg（qT/CT）～1/T呈線性關(guān)系，直線斜率為-ΔH/2.303RT，直線截距為ΔS/2.303R，因此直線回歸后可得到吸附焓ΔH和吸附熵ΔS，并得到吉布斯自由能ΔG，計(jì)算結(jié)果如下表2。

表2 BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Adsorption thermodynamics parameters of beer protein on BFSA

由表4可知，ΔH為負(fù)值，說明BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)過程是放熱的，吸附溫度越低越有利于吸附。ΔS表示的是系統(tǒng)內(nèi)微觀粒子的混亂度，吸附過程中系統(tǒng)內(nèi)部混亂度的降低用系統(tǒng)的熵值的降低來表示，由上表可知BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)的過程是熵減的過程，說明吸附過程中系統(tǒng)的混亂度在降低。ΔG＞0表明BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)過程是非自發(fā)的。

吸附放熱大小標(biāo)志著不同的吸附作用力，吸附作用力的種類可分為：化學(xué)鍵力大于60 kJ/mol，配體交換和離子作用力為40 kJ/mol，氫鍵力為2～40 kJ/mol，范德華力小于 4.4～8.8 kJ/mol，疏水作用力 4 kJ/mol。由表4得到的ΔH為-6.62 kJ/mol可知該吸附過程放熱為6.62 kJ/mol，主要作用力可能是范德華力和氫鍵和疏水作用力。范德華力是普遍存在的力，結(jié)合BFSA的表面官能團(tuán)對可能存在的氫鍵和疏水作用進(jìn)行如下推論：（1）脯氨酸是亞氨基酸，上面的N原子含有一對孤對電子，更容易形成氫鍵，故吸附過程是BFSA表面的羥基與脯氨酸上面的N原子形成氫鍵；（2）BFSA表面含有Si-O-Si，非極性官能團(tuán)具有疏水性，而由于氨基酸鏈中高比例脯氨酸會使蛋白結(jié)構(gòu)變得松散和無序，會呈現(xiàn)出最大的疏水性結(jié)合表面，因此吸附過程也可能是BFSA表面疏水官能團(tuán)與富含脯氨酸蛋白之間的疏水作用。

3 結(jié) 語

通過FT-IR測定表明BFSA表明含有OH官能團(tuán)和Si-O-Si疏水官能團(tuán)，通過BFSA吸附啤酒蛋白質(zhì)氨基酸分析，發(fā)現(xiàn)BFSA對啤酒混濁敏感蛋白有較好的吸附選擇性。

通過吸附等溫線、動力學(xué)和熱力學(xué)分析，同時(shí)結(jié)合氨基酸分析，BFSA吸附啤酒敏感蛋白機(jī)理推論如下：（1）BFSA表面羥基和富含脯氨酸蛋白之間的氫鍵作用；（2）BFSA表面Si-O-Si與富含脯氨酸蛋白之間的疏水作用。