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    紫芝子實(shí)體活性多糖的純化和結(jié)構(gòu)解析

    2019-03-14 13:29:30應(yīng)一君劉艷芳張勁松唐慶九顏夢(mèng)秋
    關(guān)鍵詞:紫芝柱層析葡聚糖

    應(yīng)一君,劉艷芳,張勁松,唐慶九,楊 焱,周 帥, 顏夢(mèng)秋,張 忠,韓 偉*

    (1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院,上海 200237;2.國家食用菌工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403)

    紫芝多糖在抗腫瘤[1-3]、抗氧化[4]、抗運(yùn)動(dòng)性疲勞和抗組織損傷[5]、免疫調(diào)節(jié)[6-8]和抗炎鎮(zhèn)痛[9]等方面都有著顯著作用。目前,已經(jīng)從紫芝子實(shí)體和菌絲體中純化出20多種多糖類物質(zhì)[10-12],其中大部分組分相對(duì)分子質(zhì)量均在10萬以下。研究人員從紫芝子實(shí)體中還分離得到相對(duì)分子質(zhì)量為1.86×106的糖蛋白 (編號(hào)為GSP-6B)和相對(duì)分子質(zhì)量為8.3×105的雜多糖(編號(hào)為GSP-4)。其中GSP-6B以β-1,6-葡萄糖殘基為主鏈,以β-1,3-和β-1,4-葡萄糖殘基為支鏈,蛋白質(zhì)約占質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.13%,具有激活樹突狀細(xì)胞的免疫活性;GSP-4以葡萄糖殘基為主鏈,以半乳糖和甘露糖殘基為支鏈,連接方式較復(fù)雜[6-7]。作者以紫芝子實(shí)體為材料,以活性實(shí)驗(yàn)為指導(dǎo),對(duì)其進(jìn)行分離純化得到均一多糖,并進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,為紫芝多糖結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系的研究提供一定的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    紫芝子實(shí)體(編號(hào)為305):浙江龍泉基地提供;9 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(Gal、Man、Ara、Glc、Rha、Fuc、Xyl):Sigma 公司產(chǎn)品;葡聚糖(Pullulan-50):Shodex 公司產(chǎn)品;細(xì)菌脂多糖(LPS)、植物凝集素(PHA):Sigma公司產(chǎn)品;青霉素和鏈霉素:Amresco公司產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(PBS):Gibco公司產(chǎn)品。

    1.2 儀器

    高效液相色譜儀 (2695型)、示差折光檢測(cè)器(2414型):Waters公司產(chǎn)品;八角度激光光散射儀:Wyatt公司產(chǎn)品;臺(tái)式高速大容量離心機(jī):Eppendorf公司產(chǎn)品;粘度檢測(cè)器:Wyatt公司產(chǎn)品;高效離子色譜儀(ICS-2500型):Dionex公司產(chǎn)品;微型漩渦混勻儀(XW-80A):Kylin-bell公司產(chǎn)品;傅里葉紅外光譜儀:Thermo Fisher公司產(chǎn)品;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:Agilent公司產(chǎn)品;DD2 600 MHz液體寬腔核磁儀:Agilent公司產(chǎn)品。

    1.3 方法

    1.3.1 多糖的提取和分離純化 精密稱取1 kg紫芝子實(shí)體粉末,加入蒸餾水,使料液體積質(zhì)量比為20 mL/g,沸水浴提取2 h,將提取液在10 000 r/min條件下離心30 min。取離心殘?jiān)?,按上述提取方法提? h后,過濾離心,合并兩次提取液,真空減壓濃縮至1 L,加入無水乙醇使醇濃度達(dá)到30%,4℃靜置 12 h,12 000 r/min離心收集沉淀 (命名為GS30),沉淀用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗滌2次后,離心,沉淀加水溶解,80℃水浴揮去乙醇后冷凍干燥。

    精密稱取醇沉干燥物50 mg溶于10 mL蒸餾水中,12 000 r/min離心15 min,棄沉淀。將上清液過DEAE-Sepharose離子柱層析進(jìn)行分析。洗脫溶劑為蒸餾水和2 mol/L NaCl,進(jìn)行梯度洗脫,流量為10 mL/min,每管收集5mL,逐管苯酚-硫酸法檢測(cè)。根據(jù)糖趨勢(shì)曲線分別收集水相2個(gè)組分 (命名為GS30W1、GS30W2)和鹽相 3個(gè)組分 (命名為GS30S1、GS30S2、GS30S3),減壓濃縮,透析,冷凍干燥。取GS30S1粗多糖干燥物配成2 mg/mL,加入無水乙醇使醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%,4℃靜置12 h,12 000 r/min離心分別收集沉淀和溶液。沉淀用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇洗滌2次后,離心,沉淀加水溶解,80℃水浴揮去乙醇后冷凍干燥 (命名為GS30S1-20E)。上清液減壓濃縮,冷凍干燥(命名為GS30S1-20S)。

    1.3.2 各組分對(duì)刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO活性的影響 RAW264.7細(xì)胞株用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:CO2體積分?jǐn)?shù)5%,37℃,濕度95%。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,調(diào)節(jié)密度為106個(gè)/mL,以每孔180 μL接種于96孔板,培養(yǎng)5 h,分別以PBS和LPS(6 μg/mL)為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照,加樣量為20 μL,以多糖樣品液為實(shí)驗(yàn)組(使終濃度分別為 50,200,500 μg/mL),在培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2)中培養(yǎng) 3 d。取上清液 100 μL,加入50 μL Griess試劑,10 min后測(cè)定543 nm處的吸光度,計(jì)算培養(yǎng)基中NO的生成量。

    1.3.3 多糖純度鑒定及相對(duì)分子質(zhì)量分析 采用苯酚-硫酸法測(cè)定GS30S1-20E樣品中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    稱取5 mg粗多糖樣品,加入1 mL流動(dòng)相充分溶解,離心,上清液用0.25 μm的水相微孔膜過濾后取100 μL進(jìn)樣分析。采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光檢測(cè)儀聯(lián)用分析技術(shù)(HPSEC-MALLS-RI)對(duì) GS30S1-20E 相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行分析。色譜柱為:G6000PWXL和G4000PWXL(7.8 mm×300 mm,TOSOH,日本)連用。流動(dòng)相:pH=7且含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮鈉的0.15 mol/L NaNO3和0.05 mol/L NaH2PO4緩沖液。以35℃的溫度和0.5 mL/min流速進(jìn)行洗脫分析,其它條件參考文獻(xiàn)[13]。

    1.3.4 單糖組成分析 稱取2~3 mg GS30S1-20E,加入3 mL濃度為2 mol/L的TFA,在110℃下水解3 h后,加入3 mL甲醇吹干,洗滌4次以上至無酸味。加入超純水溶解,定容至50 mL。色譜條件參照文獻(xiàn)[14]。

    1.3.5 甲基化分析 按照方法,精密稱取樣品2 mg于V-型樣品瓶,進(jìn)行甲基化,水解及還原和乙?;?,進(jìn)行GC-MS分析,色譜條件為:色譜柱為HP-5MS 型石英毛細(xì)管柱,30 m×250 μm×0.25 μm。載氣為氦氣,恒流模式進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度250℃,流量為1 mL/min。升溫程序:柱初始溫度160℃,2℃/min升至210℃,然后5℃/min升至240℃,一共需要7 min。傳輸線溫度280℃,不分流模式進(jìn)樣,進(jìn)樣量為2 μL。四級(jí)桿溫度150℃,離子源溫度230℃。

    1.3.6 核磁共振分析 稱取30 mg GS30S1-20E多糖樣品,加入2.0 mL的D2O,充分溶解,冷凍干燥,重復(fù)此步驟3次,最后用1.0 mL D2O和氘代DMSO的混合溶劑(體積比為1∶10)溶解樣品,進(jìn)行一維氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 紫芝多糖的柱層析分離及活性比較

    紫芝子實(shí)體熱水提取物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)30%乙醇沉淀后所得粗多糖GS30的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.20%,為了進(jìn)一步對(duì)該組分進(jìn)行純化,將其溶解后經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱洗脫分離,收集得到5個(gè)組分(圖1),分別為水洗脫部分GS30W1 和 GS30W2,NaCl洗脫部分 GS30S1、GS30S2和GS30S3,各組分多糖含量均有所提高,其中GS30S1的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到86%,證明經(jīng)過離子柱層析分離,有效富集了多糖組分。

    圖1 GS30多糖DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析分離曲線Fig.1 Elution curve of GS30 by DEAE-Sepharose Fast Flow Column chromatography

    體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO的活性結(jié)果顯示(圖2),與乙醇沉淀所得粗多糖GS30相比,經(jīng)離子柱分離所得的3個(gè)鹽相組分活性均有提高,水相的兩個(gè)組分活性降低。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),GS30S1組分的分子量較大,為了解析該多糖的結(jié)構(gòu)特征,對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步純化。

    圖2 GS30柱層析5個(gè)組分刺激RAW264.7產(chǎn)生NO的結(jié)果Fig.2 Results of five fractions of GS30 after the column chromatography on NO release from RAW264.7 cells

    2.2 紫芝多糖的純化及相對(duì)分子質(zhì)量特征和活性分析

    參考文獻(xiàn)[15]所述,以體積分?jǐn)?shù)20%乙醇沉淀法對(duì)大分子量的多糖組分GS30S1進(jìn)行純化,得到沉淀GS30S1-20E和上清GS30S1-20S,活性比較結(jié)果(圖3)顯示,沉淀GS30S1-20E活性遠(yuǎn)高于上清部分,表明通過該方法有效的保留了多糖的有效成分。

    圖3 體積分?jǐn)?shù)20%醇沉各部分刺激RAW264.7產(chǎn)生NO的結(jié)果Fig.3 Results of polysaccharide fractions by 20%ethanolprecipitation on NO release from RAW264.7 cells

    GS30S1-20E多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.63%且其水溶液在260 nm和280 nm處均無紫外吸收峰,說明該組分不含有核酸和蛋白質(zhì)。經(jīng)HPAEC測(cè)定表明該多糖只含葡萄糖一種單糖,因此判定GS30S1-20E為一種葡聚糖。

    HPSEC-MALLS-RI法分析其相對(duì)分子質(zhì)量特征,結(jié)果如圖4所示,示差檢測(cè)器(RI)信號(hào)峰為單一對(duì)稱峰,表明該多糖為均一組分,Astra軟件計(jì)算其重均相對(duì)分子質(zhì)量為2.418×106,數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為1.668×106,多分散指數(shù)為1.450,特性粘度為927.49 mL/g。

    圖4 GS30S1-20E液相圖譜Fig.4 The HPSEC spectrum of GS30S1-20E

    2.3 傅里葉紅外光譜分析結(jié)果

    GS30S1-20E紅外光譜圖譜如圖5所示,在3 328 cm-1處有一個(gè)較寬且強(qiáng)的吸收峰,該吸收峰為多糖分子內(nèi)-OH的伸縮振動(dòng)峰;在2 924 cm-1處有一個(gè)較弱的吸收峰,為多糖的C-H伸縮振動(dòng)峰,以上兩個(gè)吸收峰為多糖的特征吸收峰,表明該樣品為多糖。在1 640 cm-1的吸收峰,是C-O的伸縮振動(dòng)峰,在1 369 cm-1處的吸收峰是C-H鍵的變角振動(dòng)峰;在1 200~1 000 cm-1之間的吸收峰,表明該多糖屬于吡喃型多糖;在889 cm-1處是β-構(gòu)型的特征吸收峰,表明該多糖為β-葡聚糖。

    圖5 紫芝多糖GS30S1-20E紅外圖譜Fig.5 Infrared spectrogram of polysaccharide fraction GS30S1-20E from Ganoderma sinense

    2.4 紫芝子實(shí)體多糖GS30S1-20E甲基化分析結(jié)果

    GS30S1-20E通過甲基化后,經(jīng)GC-MS分析,如圖6和表1所示,GS30S1-20E主要包含末端連接、1,3-連接、1,3,6-連接的葡萄糖殘基,且摩爾比為 1.00∶2.32∶1.01。 表明此多糖是以 1,3-連接為主鏈,以1,6-連接為支鏈。

    圖6 GS30S1-20E的GC-MS圖譜Fig.6 GC-MS spectrum of GS30S1-20E

    表1 紫芝多糖GS30S1-20E的甲基化分析結(jié)果Table 1 Result of methylation of GS30S1-20E

    2.5 GS30S1-20E的核磁共振分析結(jié)果

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)構(gòu),對(duì)GS30S1-20E多糖進(jìn)行了核磁共振分析。從1H-NMR譜圖(圖7)可以看出,異頭氫區(qū)域有4個(gè)共振峰信號(hào),分別在δ4.76×10-6(3 個(gè) H 重疊)、δ 4.46×10-6處出現(xiàn),表明GS30S1-20E為β構(gòu)型葡聚糖。

    圖7 紫芝多糖GS30S1-20E的1H-NMR譜圖Fig.7 1H-NMR spectra ofpolysaccharide fraction GS30S1-20E from Ganoderma sinense

    從13C-NMR譜圖(圖8)可以看出,異頭碳區(qū)域的共振信號(hào)峰出現(xiàn)在 δ 102.89×10-6和 δ 102.79×10-6處,表明GS30S1-20E為β構(gòu)型,與紅外光譜結(jié)果和氫譜一致。經(jīng)與文獻(xiàn)[16]比對(duì),圖譜中δ 75×10-6、δ 76.2×10-6、δ 72.7×10-6、δ 68.3×10-6和 δ 60.8×10-6處的信號(hào)峰依次歸屬于未被取代的C3、C5、C2、C4和 C6,δ 85.9×10-6和 δ 70×10-6分別歸屬于被取代的C3和C6。該結(jié)果進(jìn)一步證明該多糖是以β-(1,3)-糖苷鍵為主鏈和 β-(1,6)-糖苷鍵為支鏈的葡聚糖。

    圖8 紫芝多糖GS30S1-20E的13C-NMR譜圖Fig.8 13C-NMR spectraofpolysaccharidefraction GS30S1-20E from Ganoderma sinense

    3 結(jié) 語

    以RAW264.7細(xì)胞釋放NO免疫活性實(shí)驗(yàn)為指導(dǎo),通過多次乙醇沉淀和DEAE陰離子交換柱層析的方法從紫芝子實(shí)體中分離得到均一多糖,該多糖重均相對(duì)分子質(zhì)量為 1.825×106, 以 β-(1,3)-糖苷鍵為主鏈和β-(1,6)-糖苷鍵為支鏈,主鏈與支鏈上糖殘基的摩爾比為3:1。目前研究表明,紫芝子實(shí)體多糖以雜多糖為主,主要的單糖有葡萄糖、半乳糖、甘露糖和巖藻糖。Lan-Zhen Meng等[17]分離得到的GSPS由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和巖藻糖組成,Gao等[11]通過超濾方法分離得到的GS-6b包含有巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成,作者從紫芝子實(shí)體中分離得到的大分子β-葡聚糖,為首次從紫芝子實(shí)體中分離得到。

    體外活性實(shí)驗(yàn)顯示該多糖能夠顯著刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO,隨著多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,其NO釋放量也逐漸增加,呈現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依賴性。NO是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞信號(hào)因子,它可參與神經(jīng)、免疫等調(diào)節(jié)作用[18]。Murata等[19]研究表明β-葡聚糖可通過刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12、IL-10、IL-6和PGE2來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)。據(jù)報(bào)道β-葡聚糖廣泛地分布于真菌、細(xì)菌和植物體內(nèi),并且真菌β-葡聚糖是公認(rèn)的活性成分之一[20],具有多種生物活性,包括免疫調(diào)節(jié)[21]、抗腫瘤[22]、抗氧化[23]等,作者分離得到的β-葡聚糖表現(xiàn)出較好的免疫活性,其免疫機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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