• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    糖尿病大鼠前額葉部位淀粉樣蛋白水平與自噬水平變化的關(guān)系研究*

    2019-03-13 03:18:16馬樓艷翟佳佳呂雅麗成蕊寧
    關(guān)鍵詞:光密度前額陽(yáng)性細(xì)胞

    馬樓艷,李 洺,翟佳佳,呂雅麗,成蕊寧

    西安市第九醫(yī)院 老年病二科(西安 710054)

    全球糖尿病患者人數(shù)迅猛增長(zhǎng),已成為中國(guó)重要的民生健康問題。糖尿病對(duì)其他疾病的影響也日益受到重視。目前,糖尿病已被視為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD )的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1],故明確糖尿病促進(jìn)AD發(fā)病的機(jī)制,有利于早期預(yù)防AD的發(fā)生發(fā)展。前期研究[2]發(fā)現(xiàn),STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬部位存在自噬的激活,但是自噬流不通,溶酶體功能出現(xiàn)異常,最終導(dǎo)致Aβ清除障礙,海馬神經(jīng)元凋亡增加。前額葉和海馬均是大腦參與學(xué)習(xí)與記憶的重要部位,既往研究[3]發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠前額葉部位存在Aβ蛋白沉積,但糖尿病大鼠前額葉部位自噬水平的情況目前鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,研究糖尿病大鼠成模第8、10、12周時(shí)的認(rèn)知功能,前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)以及前額葉部位Aβ和自噬指標(biāo)的表達(dá)情況,探討糖尿病促進(jìn)認(rèn)知障礙發(fā)生的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 藥物和試劑

    鏈脲佐菌素(STZ),Morris水迷宮及水迷宮記錄分析系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制),兔抗Aβ大鼠多克隆抗體(Abcame),兔抗大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62抗體,Trizol(TAKARA),Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(TAKARA),引物設(shè)計(jì)及合成(上海生工生物工程有限公司合成)(表1)。

    表1 各引物序列

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠90只,8~10周齡,體重180~200 g(西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為正常組(n=45)和糖尿病組(n=45)。建立經(jīng)典的STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型:所有大鼠禁食12 h后,糖尿病組大鼠腹腔注射1%的STZ(65 mg/kg),正常對(duì)照組腹腔注射等劑量生理鹽水,3 d后測(cè)大鼠尾靜脈空腹血糖,血糖≥16.7 mmol/L,提示模型建立成功。

    1.2.2 Morris水迷宮測(cè)試 分別于成模后第7、9、11周,訓(xùn)練3 d,第4天進(jìn)行隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn),分析潛伏期,考察學(xué)習(xí)能力。第5天撤去平臺(tái)進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn),去除平臺(tái)觀察2 min內(nèi)大鼠穿越中心區(qū)域的次數(shù),測(cè)試記憶能力。

    1.2.3 電鏡觀察 水迷宮測(cè)試結(jié)束后,每組取出5只大鼠,深度麻醉大鼠,采用心臟灌流的方法,留取大鼠前額葉標(biāo)本,固定。標(biāo)本制作良好后,在電鏡下觀察不同時(shí)期各組大鼠前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。

    1.2.4 qRT-PCR 抽提前額葉組織的總RNA,按照PrimeScirpt RT Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ;進(jìn)一步按照SYBR? Premix Ex TaqTMII 試劑盒說明書建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40 個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè),最末循環(huán)作熔鏈曲線分析。實(shí)驗(yàn)引物委托上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成(表1)。

    1.2.5 Western blot 提取前額葉組織總蛋白,將動(dòng)物組織放置于1.5 mL的EP管中,進(jìn)行裂解,用BCA法測(cè)定蛋白濃度,完成配置凝膠,上樣,電泳,染色,轉(zhuǎn)膜,封閉,分別孵育一抗、二抗,發(fā)光,顯影,攝像等過程。進(jìn)行條帶灰度值分析及統(tǒng)計(jì)分析。

    1.2.6 免疫組化 采用SP法免疫組織化學(xué)染色,處死大鼠,1%甲醛心臟灌注取腦,石蠟包埋連續(xù)切片,根據(jù)試劑盒說明檢測(cè)Aβ、Beclin-1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ在大鼠前額葉部位的表達(dá)。具體步驟如下:常規(guī)石蠟切片脫蠟,高壓鍋煮沸修復(fù)抗原,3%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶,正常山羊血清封閉,滴加一抗過夜,37 ℃孵育1 h,加入山羊抗兔IgG、SP復(fù)合物,DAB顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,以陽(yáng)性產(chǎn)物是棕黃色為度。蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹脂封片,顯微鏡觀察照相。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3張切片,每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野,采用ImageJ 6.0軟件測(cè)定該區(qū)域Aβ、Beclin-1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ陽(yáng)性染色神經(jīng)元的平均吸光度值,取其平均吸光度值作為結(jié)果。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果

    2.1.1 隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn) 與正常組大鼠比較,糖尿病組大鼠自第8周開始,出現(xiàn)逃避潛伏期增加(P<0.05),且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),第10周和第12周糖尿病大鼠逃避潛伏期較正常對(duì)照組均延長(zhǎng)(P<0.001)(表2)。

    2.1.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 與正常組大鼠相比,自第8周始糖尿病組大鼠穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)明顯下降(P<0.05)(表2)。

    表2 各組大鼠在成模第8、10、12周時(shí)Morris水迷宮成績(jī)

    2.2 電鏡結(jié)果

    4 000倍電鏡下可見糖尿病組大鼠前額葉神經(jīng)元細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞水腫明顯。40 000倍電鏡下可見神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,線粒體腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊不清,核質(zhì)固縮碎裂(圖1)。

    圖1 電鏡觀察各組大鼠前額葉部位超微結(jié)構(gòu)

    注:A:正常組大鼠第8周時(shí)前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×4 000);B:糖尿病組大鼠第8周時(shí)前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×4 000);C:糖尿病組大鼠第10周時(shí)前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×4 000);D:糖尿病組大鼠第12周時(shí)前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×4 000);E:正常組大鼠第8周時(shí)前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×40 000);F:糖尿病組大鼠第8周時(shí)前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×40 000);G:糖尿病組大鼠第10周時(shí)前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×40 000);H:糖尿病組大鼠第12周時(shí)前額葉神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(×40 000)

    2.3 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

    與正常組大鼠對(duì)比,第8周糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ前體(amyloid precursor protein,APP)mRNA表達(dá)升高(P=0.037),Beclin-1 mRNA表達(dá)水平升高(P=0.008)。LC3Ⅰ mRNA在第8周和第10周時(shí)與正常組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),到第12周時(shí)表達(dá)水平明顯下降(P=0.001)。LC3ⅡmRNA第8周時(shí)與正常組相比,表達(dá)水平升高(P=0.028),在第10周和第12周時(shí)表達(dá)水平均升高(P=0.011和P=0.019)(圖2~3)。

    圖2Westernblot、免疫組化及qRT-PCR檢測(cè)大鼠前額葉神經(jīng)元Aβ、APPmRNA表達(dá)情況

    注:A:qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠前額葉APP mRNA的表達(dá);B: Western blot檢測(cè)各組大鼠前額葉Aβ水平灰度值;C:免疫組化檢測(cè)各組大鼠前額葉Aβ水平的光密度值。與正常組比較,*P< 0.05,**P< 0.01;與糖尿病組第8周比較,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001

    圖3 Western blot、免疫組化及qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠前額葉神經(jīng)元相關(guān)蛋白、mRNA表達(dá)情況

    注:A:各組大鼠前額葉部位Beclin-1 mRNA表達(dá)情況;B: Western blot檢測(cè)各組大鼠前額葉部位Beclin-1灰度值; C:免疫組化檢測(cè)各組大鼠前額葉部位Beclin-1的光密度值;D:各組大鼠前額葉部位LC3Ⅰ mRNA表達(dá)情況; E:各組大鼠前額葉部位LC3ⅡmRNA表達(dá)情況;F:Western blot檢測(cè)各組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/ Ⅰ灰度值比值;G:免疫組化檢測(cè)各組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ的光密度值比值;H:Western blot檢測(cè)各組大鼠前額葉部位p62灰度值。與正常組比較,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001;與糖尿病組第8周比較,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001

    2.4 Western blot結(jié)果

    與正常組大鼠相比,糖尿病組大鼠第8周時(shí)Aβ蛋白表達(dá)明顯升高(P=0.005),第10周時(shí)Aβ蛋白表達(dá)較正常組升高(P=0.021),且高于第8周時(shí)糖尿病組的水平(P=0.035),第12周時(shí)Aβ蛋白表達(dá)升高明顯(P=0.011),同樣也高于第8周時(shí)糖尿病大鼠的表達(dá)水平(P=0.008)。且隨著時(shí)間延長(zhǎng),Aβ蛋白表達(dá)逐漸升高(r2=0.961,P<0.001)。第8周時(shí)糖尿病大鼠前額葉部位Beclin-1蛋白表達(dá)升高(P=0.035),第10周時(shí)Beclin-1蛋白表達(dá)同樣升高(P=0.005),第12周時(shí)Beclin-1蛋白表達(dá)與正常組相比升高更為明顯(P<0.001)。LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白灰度值比較結(jié)果顯示,第8周時(shí)糖尿病組大鼠前額葉部位LC3 Ⅱ/Ⅰ比值較正常組升高(P=0.005),到第10周時(shí)LC3 Ⅱ/Ⅰ比值較正常組升高(P=0.003),且高于第8周時(shí)LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)(P=0.008),第12周時(shí)糖尿病組大鼠LC3 Ⅱ/Ⅰ比值明顯高于正常組大鼠(P<0.001),且明顯高于第8周時(shí)糖尿病組的水平(P<0.001)。兩組大鼠前額葉部位p62蛋白水平在第8、10、12周時(shí)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3~4)。

    圖4Westernblot檢測(cè)各組大鼠前額葉神經(jīng)元相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

    2.5 免疫組化結(jié)果

    2.5.1 Aβ陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá) 與正常組大鼠相比,糖尿病大鼠前額葉部位自第8周始可見大量的Aβ陽(yáng)性細(xì)胞,光密度值明顯高于正常組(P=0.008),第10周時(shí)前額葉部位Aβ陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值高于正常組(P=0.004),且同樣高于第8周時(shí)Aβ表達(dá)(P=0.005)。第12周時(shí)糖尿病組Aβ陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值明顯高于正常組(P=0.003),也高于第8周時(shí)糖尿病組Aβ的表達(dá)(P<0.001)。且隨著糖尿病病程延長(zhǎng),Aβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加(r2=0.960,P<0.001)(圖2、圖5)。

    圖5 免疫組化檢測(cè)各組大鼠前額葉神經(jīng)元Aβ的表達(dá)情況(×200)

    注:A:正常組;B:糖尿病組第8周;C:糖尿病組第10周;D:糖尿病組第12周

    2.5.2 Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá) 第8周時(shí)與正常組大鼠相比,糖尿病大鼠前額葉部位可見大量的Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞,光密度值明顯高于正常組(P=0.005);第10周時(shí)前額葉部位Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值高于正常組(P=0.003),且同樣高于第8周時(shí)Beclin-1的表達(dá)(P=0.004)。第12周時(shí)糖尿病組Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值明顯高于正常組(P<0.001),也高于第8周時(shí)糖尿病組Beclin-1的表達(dá)(P<0.001)(圖3、圖6)。

    圖6免疫組化檢測(cè)各組大鼠前額葉神經(jīng)元Beclin-1的表達(dá)情況(×200)

    注:A:正常組;B:糖尿病組第8周;C:糖尿病組第10周;D:糖尿病組第12周

    2.5.3 LC3Ⅰ陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá) 與正常組大鼠相比,糖尿病大鼠前額葉部位在第8、10、12周時(shí)可見LC3Ⅰ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(圖7)。

    圖7免疫組化檢測(cè)各組大鼠前額葉神經(jīng)元LC3Ⅰ的表達(dá)情況(×200)

    注:A:正常組;B:糖尿病組第8周;C:糖尿病組第10周;D:糖尿病組第12周

    2.5.4 LC3Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá) 與正常組大鼠相比,第8、10、12周時(shí)糖尿病大鼠前額葉部位可見大量的LC3Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞(圖8)。LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白光密度值的比值顯示:第8周時(shí),糖尿病大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ比值高于正常組(P=0.005),第10周時(shí)同樣高于正常組(P=0.027),但較第8周時(shí)LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.078;第12周時(shí)糖尿病組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ光密度比值高于正常組(P=0.031),同樣高于第8周時(shí)糖尿病組LC3Ⅱ/Ⅰ光密度比值(P=0.041)(圖3)。

    圖8免疫組化檢測(cè)各組大鼠前額葉神經(jīng)元LC3Ⅱ的表達(dá)情況(×200)

    注:A:正常組;B:糖尿病組第8周;C:糖尿病組第10周;D:糖尿病組第12周

    2.5.5 Aβ表達(dá)水平與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性Western blot檢測(cè)蛋白灰度值的結(jié)果顯示,糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ表達(dá)與Beclin-1表達(dá)呈正相關(guān)(r2=0.671 0,P<0.01);免疫組化結(jié)果顯示,Aβ表達(dá)與Beclin-1表達(dá)呈正相關(guān)(r2=0.955 8,P<0.001);Western blot檢測(cè)蛋白灰度值的結(jié)果顯示,Aβ表達(dá)與LC3Ⅱ/Ⅰ的比值呈正相關(guān)(r2=0.799 2,P<0.01);免疫組化結(jié)果顯示,Aβ表達(dá)與LC3Ⅱ/Ⅰ的比值表達(dá)呈正相關(guān)(r2=0.889 1,P<0.001)(圖9)。

    圖9糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性

    注:A:Western blot結(jié)果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與LC3Ⅱ/ Ⅰ灰度值的相關(guān)性;B:Western blot結(jié)果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與Beclin-1灰度值的相關(guān)性;C:免疫組化結(jié)果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與Beclin-1光密度值的相關(guān)性;D:免疫組化結(jié)果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與LC3Ⅱ/ Ⅰ光密度值的相關(guān)性

    3 討論

    自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分,形成自噬體或自噬液泡,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新,完成對(duì)包裹物質(zhì)的降解和循環(huán)再利用。自噬在細(xì)胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。自噬抑制后導(dǎo)致變性蛋白和失能細(xì)胞器等清除延遲以及異常蓄積,從而誘發(fā)相應(yīng)的病理過程[4-5]。AD患者腦內(nèi)存在Aβ的過度聚集,最近研究[6]顯示,自噬是降解和清除異常聚集蛋白的主要機(jī)制。國(guó)外眾多學(xué)者研究[7]發(fā)現(xiàn),STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠成模第8周時(shí)即出現(xiàn)認(rèn)知功能下降,而且糖尿病大鼠成模第14周后的死亡率增加,故選取在成模第8、10、12周作為檢測(cè)糖尿病大鼠的行為學(xué)和相關(guān)指標(biāo)的時(shí)間點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn),STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在成模第8周時(shí)Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果可見潛伏期延長(zhǎng),穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)減少,表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)能力下降,提示糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯認(rèn)知功能障礙,這與國(guó)外研究結(jié)果一致。Aβ不能清除或者降解時(shí),在腦內(nèi)聚集并纖維化,進(jìn)一步形成老年斑,這是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和重要病理學(xué)基礎(chǔ)。前期研究[3]發(fā)現(xiàn),STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬及前額葉神經(jīng)元部位Aβ蛋白沉積,合并認(rèn)知障礙。本研究發(fā)現(xiàn),前額葉神經(jīng)元可見Aβ沉積,同時(shí)伴有自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)增加,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高,提示自噬激活。通常情況下,自噬水平激活,p62水平下降,清除異常聚集蛋白能力增加。但在本研究中,p62表達(dá)水平不變,同時(shí)Aβ沉積未改善,且Aβ表達(dá)與自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)性,提示可能自噬體包裹Aβ蛋白后,自噬流不通,導(dǎo)致Aβ清除障礙,大量Aβ沉積,進(jìn)一步加重神經(jīng)系統(tǒng)的損害,導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。自噬體包裹異常蛋白后,會(huì)與溶酶體融合進(jìn)一步消化分解,故推測(cè)自噬流不通的原因可能與溶酶體功能異常相關(guān),導(dǎo)致蛋白聚集后的清除障礙。這需要進(jìn)一步研究前額葉部位的溶酶體功能來明確,也是下一步研究重點(diǎn)。

    猜你喜歡
    光密度前額陽(yáng)性細(xì)胞
    3 種角膜光密度評(píng)估近視Trans-PRK術(shù)后haze的比較
    病理輔助診斷系統(tǒng)中數(shù)字濾光片的實(shí)現(xiàn)方法
    簡(jiǎn)單搓搓可養(yǎng)生
    小麥種子活力測(cè)定方法的比較
    甲狀腺素和多奈哌齊對(duì)甲狀腺功能減退癥大鼠前額葉synaptotagmin-1表達(dá)的影響
    大口黑鱸鰓黏液細(xì)胞的組織化學(xué)特征及5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的分布
    應(yīng)用數(shù)字圖像技術(shù)測(cè)量炮口火焰的方法研究
    人胎腦額葉和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育性變化
    急性白血病免疫表型及陽(yáng)性細(xì)胞比例分析
    Follistatin、Activin A與BMP-4在大鼠腦發(fā)育過程中的表達(dá)及意義
    欧美中文综合在线视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 成人永久免费在线观看视频| 在线观看www视频免费| 一a级毛片在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲五月婷婷丁香| 久久影院123| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久久国产一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 19禁男女啪啪无遮挡网站| cao死你这个sao货| 婷婷丁香在线五月| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产av精品麻豆| 日韩有码中文字幕| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品综合久久久久久久免费 | 大陆偷拍与自拍| 99精品久久久久人妻精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产成+人综合+亚洲专区| ponron亚洲| 亚洲久久久国产精品| 丝袜人妻中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产真人三级小视频在线观看| 大陆偷拍与自拍| x7x7x7水蜜桃| 亚洲一区二区三区不卡视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品粉嫩美女一区| 99在线视频只有这里精品首页| 制服人妻中文乱码| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美午夜高清在线| a在线观看视频网站| 多毛熟女@视频| 日韩精品中文字幕看吧| 久久狼人影院| 国产成人影院久久av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产乱人伦免费视频| 久久久国产欧美日韩av| 在线天堂中文资源库| 国产精品成人在线| xxxhd国产人妻xxx| 999久久久国产精品视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 男人操女人黄网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美中文综合在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 91精品三级在线观看| 国产av又大| 91老司机精品| 亚洲专区中文字幕在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久久国内视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99热国产这里只有精品6| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲成人国产一区在线观看| 99riav亚洲国产免费| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久国内视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲成人久久性| 99在线人妻在线中文字幕| 波多野结衣一区麻豆| 淫妇啪啪啪对白视频| 免费在线观看影片大全网站| 美女高潮到喷水免费观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| av电影中文网址| 亚洲成人免费av在线播放| 日韩欧美免费精品| 亚洲男人的天堂狠狠| 97人妻天天添夜夜摸| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产色视频综合| 人人澡人人妻人| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲av熟女| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 啦啦啦 在线观看视频| 欧美日韩一级在线毛片| 香蕉久久夜色| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美乱妇无乱码| 怎么达到女性高潮| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 香蕉丝袜av| 国产单亲对白刺激| 少妇 在线观看| 午夜免费观看网址| 久99久视频精品免费| 亚洲av片天天在线观看| 欧美在线黄色| 成人手机av| 免费在线观看日本一区| 免费看a级黄色片| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产成人免费无遮挡视频| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美日韩黄片免| 视频区欧美日本亚洲| 色婷婷av一区二区三区视频| 97人妻天天添夜夜摸| 88av欧美| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利,免费看| 在线观看免费午夜福利视频| 老司机亚洲免费影院| 精品人妻在线不人妻| 超色免费av| 免费观看精品视频网站| 91成人精品电影| 一级片免费观看大全| 国产高清国产精品国产三级| 日韩欧美国产一区二区入口| 电影成人av| 久久热在线av| 午夜影院日韩av| 一夜夜www| 免费av中文字幕在线| 精品国产亚洲在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费av中文字幕在线| 黄色 视频免费看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 免费高清视频大片| 女人被狂操c到高潮| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 国产精品国产av在线观看| 久久九九热精品免费| 99国产精品99久久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成人影院久久av| 一级毛片高清免费大全| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 少妇 在线观看| 国产三级黄色录像| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲三区欧美一区| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美久久黑人一区二区| 成人国产一区最新在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久久久久精品吃奶| 国产成人免费无遮挡视频| 国产又爽黄色视频| 青草久久国产| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产精品久久久久成人av| 亚洲视频免费观看视频| 99久久精品国产亚洲精品| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 十分钟在线观看高清视频www| 久久国产精品影院| 成在线人永久免费视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久人人精品亚洲av| 国产成人影院久久av| 色综合婷婷激情| 午夜a级毛片| 男人操女人黄网站| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产熟女午夜一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 黄片播放在线免费| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 精品人妻在线不人妻| 99久久国产精品久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| av有码第一页| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产又爽黄色视频| 日本wwww免费看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 1024香蕉在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 岛国在线观看网站| 久久精品人人爽人人爽视色| 高清在线国产一区| 亚洲美女黄片视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久香蕉精品热| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人欧美在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美乱妇无乱码| 欧美精品啪啪一区二区三区| 大陆偷拍与自拍| 欧美久久黑人一区二区| 精品人妻在线不人妻| x7x7x7水蜜桃| 老熟妇仑乱视频hdxx| 69av精品久久久久久| 国产99久久九九免费精品| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成人国语在线视频| 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品国内亚洲2022精品成人| 黄片小视频在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| av超薄肉色丝袜交足视频| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美激情 高清一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一夜夜www| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久这里只有精品19| 亚洲五月色婷婷综合| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产主播在线观看一区二区| 午夜老司机福利片| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人精品久久二区二区91| 中文字幕高清在线视频| 免费av毛片视频| 亚洲免费av在线视频| 妹子高潮喷水视频| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美日韩一级在线毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产伦人伦偷精品视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 午夜91福利影院| 精品乱码久久久久久99久播| 国产av一区在线观看免费| 欧美日本亚洲视频在线播放| 视频区图区小说| 老司机在亚洲福利影院| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲av成人av| 午夜免费鲁丝| 男女床上黄色一级片免费看| 9色porny在线观看| 免费av毛片视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲国产精品999在线| 在线观看日韩欧美| 999久久久精品免费观看国产| 电影成人av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 成年人黄色毛片网站| a级毛片黄视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 黄色怎么调成土黄色| 丰满的人妻完整版| 国产激情久久老熟女| 午夜免费成人在线视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 少妇 在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲av成人一区二区三| 五月开心婷婷网| 淫妇啪啪啪对白视频| 另类亚洲欧美激情| 欧美中文综合在线视频| 欧美黑人精品巨大| 欧美一级毛片孕妇| 国产一区在线观看成人免费| www国产在线视频色| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品成人在线| 激情视频va一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 欧美日韩av久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av电影在线进入| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久天堂一区二区三区四区| 国产高清国产精品国产三级| 国产91精品成人一区二区三区| 多毛熟女@视频| 国产xxxxx性猛交| 欧美丝袜亚洲另类 | 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜免费观看网址| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲欧美激情在线| 在线观看午夜福利视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 免费搜索国产男女视频| 欧美精品亚洲一区二区| 久久亚洲真实| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 午夜激情av网站| cao死你这个sao货| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜福利在线观看吧| 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美一级毛片孕妇| 久久狼人影院| 国产精品永久免费网站| 国产91精品成人一区二区三区| 男女高潮啪啪啪动态图| av视频免费观看在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 少妇的丰满在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 91麻豆av在线| 久久亚洲精品不卡| 国产高清国产精品国产三级| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲在线自拍视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲,欧美精品.| 伦理电影免费视频| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美黑人精品巨大| av天堂久久9| 亚洲成人国产一区在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99国产精品免费福利视频| 两个人看的免费小视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 窝窝影院91人妻| 99在线人妻在线中文字幕| 久久青草综合色| 在线天堂中文资源库| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲av成人av| 超碰成人久久| 国产av精品麻豆| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av熟女| 成年版毛片免费区| 午夜福利在线观看吧| 又紧又爽又黄一区二区| 久久午夜亚洲精品久久| 大型黄色视频在线免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国产av在哪里看| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产在线观看jvid| 高清av免费在线| 一a级毛片在线观看| 精品久久蜜臀av无| 国产av一区二区精品久久| 多毛熟女@视频| 一进一出好大好爽视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 91精品三级在线观看| 窝窝影院91人妻| 久久精品人人爽人人爽视色| 又黄又粗又硬又大视频| 男女下面插进去视频免费观看| 成年版毛片免费区| 亚洲五月婷婷丁香| 精品电影一区二区在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产xxxxx性猛交| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产av一区二区精品久久| 久久影院123| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 黄色怎么调成土黄色| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲精华国产精华精| 在线观看66精品国产| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 夫妻午夜视频| 亚洲av成人av| 在线观看舔阴道视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 老司机在亚洲福利影院| 香蕉国产在线看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产区一区二久久| 精品人妻在线不人妻| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产1区2区3区精品| 极品教师在线免费播放| 757午夜福利合集在线观看| 精品福利永久在线观看| 欧美日韩黄片免| 久99久视频精品免费| 男女午夜视频在线观看| 大码成人一级视频| 国产精品国产av在线观看| 午夜免费鲁丝| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美精品亚洲一区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜影院日韩av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 日本一区二区免费在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 国产单亲对白刺激| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品一区二区在线不卡| 在线天堂中文资源库| 91九色精品人成在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 免费观看人在逋| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 真人一进一出gif抽搐免费| 18禁观看日本| 中文字幕色久视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| av网站在线播放免费| 精品乱码久久久久久99久播| 99精品在免费线老司机午夜| 露出奶头的视频| 美国免费a级毛片| a级毛片在线看网站| 久久婷婷成人综合色麻豆| 视频区图区小说| 97碰自拍视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜福利欧美成人| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 香蕉久久夜色| 99riav亚洲国产免费| 日韩免费av在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美精品亚洲一区二区| 久久性视频一级片| 91字幕亚洲| aaaaa片日本免费| 国产主播在线观看一区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 极品教师在线免费播放| 亚洲五月色婷婷综合| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲国产精品sss在线观看 | 天天影视国产精品| 黄色丝袜av网址大全| av有码第一页| 欧美精品啪啪一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 1024香蕉在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久久久精品吃奶| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 老司机福利观看| 天堂动漫精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久伊人香网站| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 超色免费av| www.自偷自拍.com| 91麻豆av在线| 99在线人妻在线中文字幕| 不卡av一区二区三区| 久久九九热精品免费| 久久人人精品亚洲av| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成年人精品一区二区 | 日韩大码丰满熟妇| www.自偷自拍.com| 男女高潮啪啪啪动态图| 91成年电影在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 多毛熟女@视频| 视频区欧美日本亚洲| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲av美国av| 国产免费男女视频| 制服诱惑二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| xxxhd国产人妻xxx| 久久久久久久精品吃奶| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品日韩av在线免费观看 | 精品久久久久久,| 免费av中文字幕在线| 淫秽高清视频在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩有码中文字幕| 婷婷六月久久综合丁香| 在线观看免费高清a一片| 最近最新免费中文字幕在线| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品一区二区在线不卡| 免费高清在线观看日韩| 麻豆成人av在线观看| av片东京热男人的天堂| 88av欧美| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 在线观看免费午夜福利视频| 两个人免费观看高清视频| 亚洲av片天天在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 9色porny在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品 欧美亚洲| 国产免费现黄频在线看| 亚洲欧美激情在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美黑人精品巨大| 9191精品国产免费久久| 中国美女看黄片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久热在线av| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品电影一区二区在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 一级a爱视频在线免费观看| e午夜精品久久久久久久| 亚洲第一青青草原| 久久久久久久久免费视频了| 欧美日韩乱码在线| 妹子高潮喷水视频| 精品久久久久久成人av| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 男人操女人黄网站| 亚洲国产看品久久| 国产1区2区3区精品| 99riav亚洲国产免费| 国产精品久久久av美女十八| 丁香六月欧美| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲伊人色综图| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产91精品成人一区二区三区| 国产免费男女视频| 日韩有码中文字幕| 宅男免费午夜| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久久国产成人免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 制服诱惑二区| 亚洲国产精品sss在线观看 | 深夜精品福利| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲免费av在线视频| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品免费视频内射| 女人精品久久久久毛片| 91精品三级在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 中出人妻视频一区二区|