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    直接抗病毒藥物治愈的慢性丙型肝炎患者NK細胞的免疫學特點分析

    2019-03-13 02:16:28周文靖史繼靜李元元王福生
    傳染病信息 2019年1期
    關鍵詞:免疫學表型抗病毒

    周文靖,史繼靜,李元元,王福生

    慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)是由HCV感染引起的一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病。病毒持續(xù)復制,機體HCV特異性免疫功能低下,誘發(fā)肝臟組織發(fā)生天然免疫和適應性免疫的損傷是CHC發(fā)生的主要病理基礎[1-2]。機體適應性免疫尤其是細胞免疫在清除病毒過程中起重要作用,但天然免疫亦是機體抗HCV感染不可或缺的關鍵部分[3]。NK細胞作為機體天然免疫系統(tǒng)的主要成分,不僅在HCV感染早期病毒的自發(fā)性清除中發(fā)揮重要作用[4],還與慢性感染階段抗病毒治療效果有關[5]。當前,臨床采用直接抗病毒藥物(direct-acting antivirals,DAAs)可以治愈CHC,且療程短、服用方便、安全性好,較干擾素抗病毒治療具有極大的優(yōu)勢[6]。DAAs治療已逐漸替代聚乙二醇干擾素- α/利巴韋林方案,成為國內(nèi)外治療CHC的主要手段。

    目前有關DAAs治療慢性HCV感染的研究較多集中在臨床療效方面,有關機體免疫學變化的研究較少。本研究對接受達拉他韋(daclatasvir,DCV)和阿舒瑞韋(asunaprevir,ASV)治療的初治型HCV 1b型CHC患者外周血NK細胞表型和功能進行研究,以探索DAAs治療對機體NK細胞免疫學特點的影響。

    1 對象與方法

    1.1 對象與材料

    1.1.1 對象 納入2015年9月 2016年11月于原解放軍第三〇二醫(yī)院門診就診,且接受DCV/ASV治療的初治型HCV 1b型CHC患者13例。入組標準:①年齡≥18周歲;②僅為HCV 1b型感染;③初治受試者定義為既往未曾暴露于任何干擾素制劑、利巴韋林和DAAs;④篩選時HCV RNA≥104IU/ml ;⑤HIV-1和血清HBsAg陰性。排除標準:①有證據(jù)顯示除HCV感染以外的疾病所導致的慢性失代償性肝病,包括但不限于腹水、靜脈曲張出血或肝性腦??;②確診或疑似肝細胞癌或其他惡性腫瘤;③TBIL≥2 mg/dl(34 μmol/L);④ ALT ≥ 5×ULN;⑤白蛋白<3.5 g/dl(35 g/L); ⑥ AFP > 100 ng/ml(82.6 IU/ml)或AFP≥50 ng/ml且≤100 ng/ml(≥41.3 IU/ml且≤82.6 IU/ml)的受試者須進行肝臟超聲檢查,如疑似肝細胞癌則應排除;⑦HGB<8.5 g/dl(85 g/L);⑧中性粒細胞絕對計數(shù)<0.5×109/L;⑨PLT<50×109/L;⑩未受控制的糖尿病或高血壓;中、重度抑郁癥。所有患者均接受24周的DCV/ASV治療,治療結(jié)束后隨訪24周。另納入健康對照(healthy control,HC)13例(表1)。入組的所有受試者均簽署知情同意書。

    表1 入組患者和健康對照的基線臨床資料Table 1 Baseline clinical data for enrolled CHC patients and healthy controls

    1.1.2 材料 鼠抗人CD3-BV421、CD56-Percp、CD56-BV510、CD16-FITC、HLA-DR-BV421、CD38-PE-cy7、NKP46-BV510、NKP30-BV421、IFN-γ-PE-cy7、TNF-α-PE 等熒光抗體均購自美國Biolegend公司;鼠抗人NKG2A-PE購自美國R&D公司;CD107a-FITC熒光抗體、Golgistop、破膜劑及破膜洗液均購自美國BD公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)、離子霉素(ionomycin,IONO)、1%多聚甲醛均購自美國Sigma公司;淋巴細胞分離液購自天津美德太平洋公司;IL-12購自美國PeproTech公司;IL-18購自美國Biovision公司;HCV核酸定量檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 HCV核酸定量檢測 使用HCV核酸定量檢測試劑盒定量檢測HCV RNA水平,該試劑盒的定量下限為50 IU/ml,檢測下限為25 IU/ml,HCV RNA<25 IU/ml定義為檢測不到。

    1.2.2 外周血單個核細胞的分離與凍存 分別于CHC患者接受治療第0周、1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周、16周、24周及治療結(jié)束后隨訪第4周、12周、24周采集EDTA抗凝外周靜脈血,另外分別采集13例HC外周抗凝靜脈血,1500 r/min離心10 min,留取血漿,將剩余細胞懸液用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離獲取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用含90%FBS和10%DMSO的細胞凍存液進行凍存。

    1.2.3 NK細胞表型分子流式染色 復蘇凍存的PBMCs,調(diào)整濃度為 5×106/ml,取 100 μl置于流式管中加入表型抗體(CD3、CD56、CD16、CD38、HLA-DR、NKP30、NKP46、NKG2A),混勻,室溫避光孵育25 min;加入1 ml PBS,混勻,離心洗滌,1500 r/min,5 min;棄上清,拍干;用200 μl 1%多聚甲醛液重懸細胞,4 ℃避光保存,24 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

    1.2.4 NK細胞脫顆粒(CD107a)和釋放IFN-γ、TNF-α檢測 復蘇凍存的PBMCs,用含10%FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液重懸,按5×105/孔鋪入96孔細胞培養(yǎng)板中;向指定培養(yǎng)孔內(nèi)分別加入刺激因子 [PMA(50 ng/ml)+IONO(1 μg/ml)、IL-12(50 ng/ml)+IL-18(50 ng/ml)],同時向每孔加入 Golgistop(10 μg/ml)和鼠抗人CD107a熒光抗體,混勻,放入37 ℃ CO2細胞培養(yǎng)箱孵育6 h;收集細胞至流式管中,加入1 ml PBS,震蕩混勻,1500 r/min離心5 min洗去刺激劑;棄上清液,加入表型抗體(CD3、CD16、CD56),避光孵育25 min;PBS洗滌后加入破膜劑,4 ℃避光破膜30 min;破膜洗液洗滌后加入IFN-γ、TNF-α單抗,避光孵育25 min;破膜洗液洗滌后,用300 μl 1%多聚甲醛液重懸細胞,4 ℃避光保存,24 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

    1.2.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,并用GraphPad Prism 6.0進行圖形繪制。定量資料以中位數(shù)(最小值,最大值)表示,CHC患者與HC各不同治療時間點之間的比較采用Mann-Whitney非參數(shù)U檢驗,CHC患者不同治療時間點之間的兩兩比較采用Wilcoxon配對符號秩檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 DCV/ASV治療過程中CHC患者血清HCV RNA水平 對13例患者進行DCV/ASV抗病毒治療,并在治療過程中動態(tài)監(jiān)測患者血清HCV RNA水平。結(jié)果顯示,13例患者治療前的HCV RNA水平為6.82(4.31,7.29)log IU/ml,所有患者在接受DCV/ASV治療2周內(nèi)血清HCV RNA均下降至檢測不到的水平(HCV RNA<25 IU/ml),并一直維持到隨訪結(jié)束。

    2.2 DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞表型變化 外周血NK細胞表型檢測分析結(jié)果顯示,與HC組相比,CHC患者治療前外周血NK細胞活化程度較高,表達HLA-DR(U=43.000,P=0.037)(圖1A)、CD38(U=39.500,P=0.023)(圖1B)和NKP46(U=13.000,P< 0.001)(圖1C)的水平顯著升高;表達NKP30(圖1D)和NKG2A(圖1E)的水平無明顯差異。接受DAAs治療后HLA-DR的表達水平顯著下降,且與HC組無顯著性差異(圖1A)。隨訪結(jié)束時NKP46的表達水平較治療前顯著下降(Z=84.000,P=0.007),但仍高于HC組(U=31.000,P=0.008)(圖1C)。

    圖1 DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞表型分析A~E.DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞HLA-DR、CD38、NKP46、NKP30、NKG2A的表達水平;0.治療第0周(治療前);24.治療第24周;FU 12 、FU 24.治療結(jié)束后隨訪第12周、24周;*.P<0.05Figure 1 Phenotypic analysis of NK cells in CHC patients treated with DCV/ASV

    2.3 DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞毒性和功能的檢測 在體外分別用PMA+IONO、IL-12+IL-18刺激來源于CHC患者和HC的PBMCs,通過流式細胞術檢測NK細胞分泌CD107a、IFN-γ和 TNF-α的能力。結(jié)果顯示:IL-12+IL-18刺激下,CHC患者治療前分泌CD107a(U=16.000,P=0.002)和 TNF-α(U=36.000,P=0.040)的能力均較HC顯著增高(圖2A、2C),產(chǎn)生IFN-γ的能力顯著降低(U=28.000,P=0.012)(圖2B);DAAs治療后,CHC患者在隨訪12周時CD107a的表達水平較治療前有顯著下降(Z=3.000,P=0.005)但仍高于HC(U=33.000,P=0.026),隨訪結(jié)束時與HC無明顯差異(圖2A);CHC患者NK細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力在DAAs治療后明顯增強(Z=71.000,P=0.012)(圖2B)。PMA+IONO刺激下,3種細胞因子的表達水平在組間及組內(nèi)不同時間點無明顯差異(圖3)。

    圖2 IL-12+IL-18刺激下DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞毒性和功能的變化A~C.IL-12+IL-18刺激下DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞分泌細胞因子CD107a、IFN-γ和TNF-α的能力;0.治療第0周(治療前);24.治療第24周;FU 12 、FU 24.治療結(jié)束后隨訪第12周、24周;*.P<0.05Figure 2 Changes of NK cells cytotoxicity and function in CHC patients treated with DCV/ASV in response to IL-12 +IL-18 stimulation

    圖3 PMA+IONO刺激下DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞毒性和功能的變化A~C.PMA+IONO刺激下DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞分泌細胞因子CD107a、IFN-γ和TNF-α的能力;0.治療第0周(治療前)24.治療第24周;FU 12 、FU 24.治療結(jié)束后隨訪第12周、24周Figure 3 Changes of NK cells cytotoxicity and function in CHC patients treated with DCV/ASV in response to PMA +IONO stimulation

    3 討 論

    天然免疫是機體抗病毒感染的第一道防線,對控制病毒感染和有效啟動獲得性免疫至關重要。NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成成分,在HCV感染的各階段均發(fā)揮著關鍵作用[7]。有研究表明,慢性HCV感染階段患者NK細胞的活化程度增高、細胞毒性增強,但分泌IFN-γ的能力受損,不利于病毒的清除[8-10]。

    DAAs的出現(xiàn)使CHC患者得以治愈,但DAAs治療對機體免疫系統(tǒng)的影響目前仍不十分清楚。有研究顯示,DAAs介導的HCV清除伴隨有NK細胞免疫學功能的變化[11-15]。但亦有學者報道DAAs治療后,CHC患者NK細胞的免疫學變化尚不確定,仍須進一步討論[16]。

    HCV 1b型是我國HCV感染最常見的基因型[17],DCV/ASV作為國內(nèi)首個獲批的DAAs聯(lián)合治療方案,對HCV 1b型CHC患者治愈率高、安全性與耐受性良好。本研究發(fā)現(xiàn)13例CHC患者接受DCV/ASV治療24周后均獲得持續(xù)病毒學應答。對其免疫學特點進行分析發(fā)現(xiàn),CHC患者治療前外周血NK細胞表達HLA-DR、CD38、NKP46、CD107a的水平顯著增高,表達IFN-γ的水平顯著降低,表明CHC患者外周血NK細胞活化程度增高,細胞毒性增強,但產(chǎn)生IFN-γ的能力減弱,這與既往研究報道一致[8-10]。此外,我們通過對DAAs治療的患者不同隨訪時間點的外周血NK細胞表型和功能特點進行比較,發(fā)現(xiàn)治療后患者NK細胞HLA-DR、NKP46、CD107a的表達水平顯著下降,同時IFN-γ的表達水平顯著升高,表明DAAs治愈的CHC患者外周血NK細胞的活化程度和細胞毒性降低,分泌IFN-γ的能力增強。同時,本研究還發(fā)現(xiàn),CHC患者在接受DAAs治療前及治療過程中NK細胞表達NKP30和NKG2A的水平并未發(fā)生明顯改變,這與既往的研究結(jié)果不同,先前研究認為CHC患者治療前外周血NK細胞表達NKP30和NKG2A的水平顯著增高,且經(jīng)DAAs治療之后其表達水平均顯著下降[11-12,14],造成這種差異的原因可能與入選病例的種族、治療經(jīng)歷、HCV基因型及采用DAAs治療方案的不同有關。

    總之,本研究發(fā)現(xiàn)DAAs在快速抑制CHC患者體內(nèi)HCV達到治愈水平的同時,伴隨NK細胞免疫功能的變化。然而,由于入組病例數(shù)較少,患者感染的HCV基因型及采用的DAAs治療策略單一,研究存在著一定的局限性,有關DAAs治療對機體免疫系統(tǒng)的影響及其具體機制有待進一步探索與驗證。

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