非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

何 洋，康樺華，馮銹華，向 華，陳 晶，黃 忠，袁子國，王曉虎

非洲豬瘟（African swine fever,ASF），是以非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）為病原所引起的急性、熱性、高傳染性、超高致死性的疾病，一旦發(fā)病，無藥可治，病死率可達(dá)100%，屬于國際動(dòng)物衛(wèi)生組織A類疫病，也是我國一類疫病之一[1]。ASFV是一種巨大的20面體結(jié)構(gòu)的DNA病毒，其基因組為線性雙鏈DNA分子，不同分離株的大小存在差異，長度在170～193 nm之間。由于ASFV介于痘病毒與虹膜病毒之間的特征，研究者將其劃分為非洲豬瘟病毒屬，且是惟一成員[2]。ASFV主要依賴巨噬細(xì)胞及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，以宿主巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞[3-4]。根據(jù)其毒力差異，可分為高致病性、中等毒力、低毒力及感染無臨床癥狀的毒株。

ASF首次報(bào)道于1921年。1909 1915年東非暴發(fā)了一種由病毒所引起的針對(duì)家豬的致命性疾病，當(dāng)時(shí)認(rèn)為這是一種由豬瘟病毒變異所導(dǎo)致的疾病，因該病多發(fā)生于復(fù)雜的非洲野生環(huán)境中，故研究者將野生動(dòng)物，特別是疣豬視為主要的傳染源[5]。后來研究發(fā)現(xiàn)，ASF是由在疣豬巢穴內(nèi)生長的一種攜帶ASFV的軟蜱持續(xù)傳播所致，ASFV是一種以蟲媒介為主要傳播方式的病毒[6]。在20世紀(jì)上半葉，ASF僅肆虐于東非以及南非部分國家，對(duì)該地區(qū)的家豬養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的沖擊[7]。1957年，ASF以安哥拉為跳板，首次進(jìn)入了歐洲國家，雖然很快在葡萄牙的里斯本地區(qū)被撲滅，但未能將其徹底根除，在之后很長一段時(shí)間內(nèi)流行于撒丁島。直至1995年，隨著西班牙疫情的撲滅[8]，歐洲范圍內(nèi)的ASF疫情才得以控制。然而，野豬作為ASFV的攜帶者，其生活習(xí)性為病毒的傳播與流行提供了極大助力，使得ASF在2007年再度流行，并進(jìn)一步向東歐、美洲和亞洲蔓延[9]。2018年8月我國暴發(fā)了第一起ASF疫情，并逐步在我國境內(nèi)蔓延。目前針對(duì)ASF，尚未研制出能提供全面保護(hù)的疫苗。本文主要針對(duì)ASF的疫苗研制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行綜述，以期為ASF的防治提供思路與方向。

1 滅活疫苗

滅活疫苗，是通過物理或化學(xué)手段，使病原微生物喪失感染性與毒性，又保留免疫原性的一類疫苗。ASF疫苗的生產(chǎn)最初也嘗試?yán)眠@種經(jīng)典的疫苗制備手段，但遺憾的是，利用感染ASFV的豬肺泡巨噬細(xì)胞或者感染脾臟勻漿所制備的滅活疫苗既無法檢測(cè)到血清學(xué)反應(yīng)，也未能產(chǎn)生針對(duì)同源病毒的保護(hù)性免疫。而接種經(jīng)純化或超聲處理的感染細(xì)胞所制備的滅活疫苗后，雖然確實(shí)能夠誘導(dǎo)接種動(dòng)物產(chǎn)生抗體，且可以從血清中檢測(cè)到，但是依然無法保護(hù)接種動(dòng)物免受病毒侵害[10-11]。

如果說滅活疫苗自身免疫原性的缺陷是導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)較弱甚至不產(chǎn)生免疫應(yīng)答現(xiàn)象的原因，那么與免疫佐劑聯(lián)用的效果又如何呢？Blome等[12]利用最先進(jìn)的免疫佐劑Polygen TM與Emulsigen重新分別與滅活A(yù)SF疫苗聯(lián)用，評(píng)估結(jié)果仍然與之前類似，即雖然可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，但是卻不能與ASFV發(fā)生中和反應(yīng)，自然也無法使接種動(dòng)物獲得免疫性保護(hù)，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)過高的抗體水平反而可能會(huì)影響疫苗的功效。目前看來，由于抗體在ASF中的免疫保護(hù)作用尚不清楚，故滅活疫苗的使用還須更進(jìn)一步地探討與研究。

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是一種經(jīng)典的傳統(tǒng)疫苗，它是通過自然篩選或人工致弱等手段處理后培養(yǎng)制備的弱毒株。由于弱毒活疫苗利用方便，成本低廉，免疫原性好，免疫期長的特點(diǎn)，一直屬于主流的流行病防控手段[13]。研究者針對(duì)ASFV的弱毒疫苗研制主要可分為兩大類，即天然弱毒疫苗與人工弱毒疫苗。

2.1 天然弱毒疫苗 ASFV/NH/P68與OUR/T88/3是ASFV的兩類天然弱毒株。其中ASFV/NH/P68能夠促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）與NK細(xì)胞的活性，并且經(jīng)ASFV/NH/P68免疫后的家豬可以抵御ASFV/L60強(qiáng)毒株的攻擊[14-15]，但是會(huì)引起部分免疫豬出現(xiàn)慢性感染的現(xiàn)象。

經(jīng)OUR/T88/3免疫的家豬，能夠抵御OUR/T88/1毒株的攻擊，但是隨著CD8+T淋巴細(xì)胞的消耗，也會(huì)使免疫效果減退，造成對(duì)OUR/T88/1毒株的不完全保護(hù)[16]，提示CD8+T淋巴細(xì)胞在ASFV的保護(hù)性免疫中占重要角色。受OUR/T88/3免疫的家豬，同樣能夠?qū)enin 97/1分離株與genotype X Uganda分離株產(chǎn)生免疫[17]，表明利用OUR/T88/3毒株制備具有交叉保護(hù)作用的疫苗具有可行性。在不同區(qū)域以不同劑量的OUR/T88/3免疫動(dòng)物，可產(chǎn)生不一樣的免疫效果，它們的差距甚至達(dá)到了1.5～2.0倍，提示免疫方式與劑量也會(huì)對(duì)免疫效果造成影響[18]。與一般的天然弱毒疫苗免疫接種動(dòng)物后造成或輕或重的不良反應(yīng)一樣，受OUR/T88/3免疫的動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀[16-18]。天然弱毒疫苗存在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)限制了其作為防控疫苗的實(shí)際使用價(jià)值與可行性。

2.2 人工弱毒疫苗 人工弱毒疫苗又可以分為傳代致弱毒活疫苗與重組致弱毒活疫苗。ASFV可在豬源細(xì)胞系如Vero與CV1內(nèi)不斷傳代，降低其毒力。然而由于病毒外膜脂質(zhì)的差異，之前可產(chǎn)生中和反應(yīng)的血清對(duì)以傳代方式降低毒力的毒株不再具備好的中和活性[19]。歷史上，在西班牙與葡萄牙兩國，都曾有過利用傳代致弱毒株免疫動(dòng)物卻產(chǎn)生災(zāi)難性后果的記錄，所免疫動(dòng)物呈現(xiàn)出急性與慢性的ASF癥狀，大量死亡，而存活下的動(dòng)物也多數(shù)攜帶ASFV，成為之后ASF疫情的傳染源，這種情況導(dǎo)致了傳代致弱毒活疫苗開發(fā)與應(yīng)用的延滯[20]。

雖然目前關(guān)于傳代致弱毒活苗的開發(fā)并不樂觀，但是依然有不少的研究小組在進(jìn)行嘗試。Krug等[21]將ASFV-G（佐治亞共和國株）在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代后發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)增多，毒株毒力不斷下降，在第110代完全喪失毒力，并且不能賦予免疫動(dòng)物對(duì)ASFV-G的免疫。同時(shí)其在原代豬巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力下降，而在Vero細(xì)胞內(nèi)的增殖能力隨傳代次數(shù)增多而增強(qiáng)。Lacasta等[22]則發(fā)現(xiàn)，將用強(qiáng)毒E75在CV1細(xì)胞系上傳代致弱的E75CV1毒株進(jìn)行免疫后發(fā)現(xiàn)，弱毒株產(chǎn)生了與親本截然不同的免疫途徑，并且E75CV1能免疫同源E751的攻擊，但不能對(duì)異源毒株BA71產(chǎn)生保護(hù)性免疫。目前來看，傳代致弱毒活疫苗雖然仍存在生物安全問題，但同樣有機(jī)會(huì)成為抗ASFV的候選疫苗之一。

重組致弱毒活疫苗則是利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒的基因、結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變來實(shí)現(xiàn)病毒毒力的減弱，以此開發(fā)的對(duì)機(jī)體低毒性而又能長期免疫的疫苗。ASFV入侵機(jī)體總伴隨著各種逃避宿主免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，比如通過A238L蛋白來抑制T細(xì)胞中NF-κB和核激活因子，或者由EP402R和EP153R基因編碼的CD2v凝集素樣蛋白調(diào)節(jié)宿主的防御，亦或通過多基因家族蛋白（MGF505-2R）改變干擾素的產(chǎn)生[23]。

科學(xué)家們則以此為方向，利用分子生物學(xué)手段，嘗試制備重組致弱毒活疫苗。Borca等[24]構(gòu)建了CD2樣蛋白8-DR缺陷性ASFV毒株，并檢測(cè)其功能變化，研究發(fā)現(xiàn)雖然未降低毒株毒力，但是能抑制宿主的免疫活性，提示8-DR參與了病毒早期的感染過程。Abrams等[25]則將OUR/T88/3中的DP71L與DP96R基因敲除，使其毒力降低，并構(gòu)建了缺陷性毒株OUR/T88/3DeltaDP2。免疫后發(fā)現(xiàn)相較于親本OUR/T88/3的免疫效果來說，缺陷性毒株產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果僅為66%。這提示毒株毒力的強(qiáng)弱可能會(huì)影響其免疫保護(hù)的效果。Vivian等[26]則利用ASFV-G毒株構(gòu)建了B119L基因缺陷性ASFV-G-Δ9GL，發(fā)現(xiàn)低劑量的缺陷性毒株不僅不會(huì)誘發(fā)毒性反應(yīng)，甚至在感染第21 d與28 d分別賦予了機(jī)體部分及完全性的免疫保護(hù)。Reis等[27]以Benin 97/1為模板分別構(gòu)建了MGF530及MGF360缺陷性毒株BeninΔMGF，研究發(fā)現(xiàn)所有免疫豬除了有發(fā)熱癥狀外無其他臨床癥狀，并且都能抵御Benin 97/1的攻擊，而在接種缺陷性毒株后，以O(shè)UR/T88/3株加強(qiáng)免疫，仍有75%的免疫保護(hù)效果。

IFN調(diào)節(jié)的缺失，也是構(gòu)建減毒ASFV毒株的思路之一。O'Donnell等[28]在之前的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，敲除了基因UK（DP96R），發(fā)現(xiàn)可以實(shí)現(xiàn)高劑量下的無毒性誘導(dǎo)，僅僅兩周就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)ASFV-G 2007分離株的免疫?？梢哉f是目前為止最為成功的實(shí)驗(yàn)性弱毒活疫苗。以此看來，部分重組致弱毒活疫苗已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了一定程度的生物安全保證，但是敲除的基因是否會(huì)對(duì)病毒造成其他影響而導(dǎo)致免疫失效仍須要繼續(xù)驗(yàn)證。

3 核酸疫苗

核酸疫苗是一種利用病原體的抗原基因與真核表達(dá)載體重組構(gòu)成的質(zhì)粒，當(dāng)其轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，能表達(dá)病原體的有效抗原成分，引起保護(hù)性免疫[29]。有嘗試?yán)煤怂嵋呙缈笰SFV感染的研究，但是卻因核酸疫苗在大型動(dòng)物體內(nèi)免疫原性不樂觀的情況而備受爭議。隨著對(duì)ASFV的深入研究，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)是ASFV免疫過程中的關(guān)鍵[30]。為了加強(qiáng)核酸疫苗的免疫原性，Argilaguet等[31]通過將ASFV基因P54與P30串聯(lián)為PQ后與豬白細(xì)胞抗原II的抗體可變片段框APCH1融合，構(gòu)建成新的質(zhì)粒pCMVAPCH1PQ，雖然可以令豬對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力成倍增強(qiáng)，但無法針對(duì)致死性ASFV提供免疫性保護(hù)，也無法產(chǎn)生中和反應(yīng)。Argilaguet等[32]將ASFV基因P54與P30，ASFV血凝素（sHA）的決定簇及泛素融合，構(gòu)建了新的質(zhì)粒載體pCMVUbsHAPQ，旨在增強(qiáng)誘導(dǎo)CTL的效應(yīng)。該質(zhì)粒成功誘導(dǎo)了豬的體液與細(xì)胞免疫，并且使部分免疫豬在致死性ASFV-E75的攻擊下得到保護(hù)。這提示細(xì)胞免疫與預(yù)防ASF密切相關(guān)。該課題組還發(fā)現(xiàn)，通過表達(dá)文庫可使約60%的免疫豬免于ASFV-E75的攻擊，提示單一的基因表達(dá)免疫僅能提供有限的保護(hù)能力，而ASFV基因組中還存在著其他影響免疫應(yīng)答的因素[33]，仍須要更進(jìn)一步地深入研究。

4 亞單位疫苗

亞單位疫苗多是利用病原體不含核酸的表面抗原，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的一種疫苗?？蒲腥藛T利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了ASFV的P12蛋白，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)P12蛋白能夠以劑量依賴的形式抑制多種ASFV分離株在體外豬肺泡細(xì)胞上的增殖復(fù)制，但是卻無法提供免疫性保護(hù)[34]，這提示P12作為ASFV的附著蛋白影響了病毒的早期感染。ASFV的P72蛋白、P54蛋白及P30蛋白的抗體，能夠在病毒攻擊易感細(xì)胞后中和病毒，抑制病毒的依附、復(fù)制及內(nèi)化的過程[34]。雖然分別利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)P30蛋白、P54蛋白、P72蛋白及P22蛋白都可以有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但是并不能提供有效的免疫保護(hù)，而當(dāng)聯(lián)用P30蛋白與P54蛋白共同免疫時(shí)，卻產(chǎn)生了不同程度甚至完全性的免疫保護(hù)[35-37]。這表明單一抗原引起的免疫應(yīng)答不足以提供全面的保護(hù)，由抗體介導(dǎo)的保護(hù)作用之間也存在互補(bǔ)的關(guān)系。近年來，通過將載體表達(dá)ASFV抗原引發(fā)免疫原性作為首免，然后利用減毒活疫苗加強(qiáng)免疫的策略，擴(kuò)寬ASFV表位的識(shí)別，這也是一種亞單位疫苗與傳統(tǒng)疫苗聯(lián)用的防治思路[38]，因此，鑒定更多的ASFV保護(hù)性抗原，開發(fā)新型的免疫佐劑，都是提高ASFV基因工程亞單位疫苗免疫效力的可行思路。

5 病毒活載體疫苗

許多研究表明，細(xì)胞免疫在抗ASFV中扮演重要角色，而CTL的效應(yīng)更是免疫效果的保證[31-33]。因此，有學(xué)者利用病毒活載體可在機(jī)體內(nèi)持續(xù)復(fù)制與表達(dá)的特性，研制以腺病毒、甲病毒為載體重組ASFV部分抗原基因的病毒載體疫苗。Lokhandwala等[39]構(gòu)建了混合ASFV-P32、P54、P62和P72抗原的腺病毒載體疫苗，獲得了較好的抗原特異性CTL應(yīng)答。而Murgia等[38]則利用甲病毒載體，分別構(gòu)建表達(dá)ASFV p30（RP-30）、p54（RP-54）、pHA72（RP-sHA-p72）的抗原載體，并且在Vero細(xì)胞中獲得的重組病毒RP-30具有較好的免疫原性。目前關(guān)于病毒活載體疫苗的安全性仍須要通過攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

6 展 望

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，針對(duì)ASF的防治疫苗，也從開始的滅活疫苗嘗試，向針對(duì)病毒感染宿主的特定機(jī)制入手。雖然在ASFV功能結(jié)構(gòu)、入侵方式及宿主對(duì)ASFV的免疫應(yīng)答方面取得不少成果，并以此嘗試了多類別的疫苗開發(fā)而獲得了一定效果，但是，仍然無法改變尚無有效疫苗可用的現(xiàn)狀。目前看來，弱毒活疫苗由于能在保留病毒較完整結(jié)構(gòu)的前提下，最大限度的降低毒力，并且可在機(jī)體內(nèi)復(fù)制，持續(xù)誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生，成為可提供高效、安全的保護(hù)性疫苗的首選。但是，它的缺點(diǎn)也同樣無法忽視，如復(fù)雜環(huán)境下可能出現(xiàn)的毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，對(duì)易感動(dòng)物的攻擊性等都是必須要面對(duì)的生物安全問題。

我們對(duì)目前ASF滅活疫苗、弱毒活疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗以及病毒活載體疫苗的研究進(jìn)展及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行簡要匯總（表1）。此外，除了利用疫苗作為對(duì)抗ASFV手段，也有直接針對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程來抑制病毒增殖的手段，例如利用RNA干擾技術(shù)，敲降A(chǔ)SFV的A151R和VP72基因，抑制病毒的體外復(fù)制能力[40]，或者利用有機(jī)試劑氟喹諾酮，金雀異黃酮直接阻斷ASFV DNA的復(fù)制，干擾其復(fù)制周期，達(dá)到抑制病毒增殖的目的[41-42]。這些都為ASF的防治提供了新的手段。從長遠(yuǎn)來看，高效安全的特異性疫苗仍舊是防治ASF的最佳手段，因而更高效的免疫佐劑探索，更可靠的生物安全風(fēng)險(xiǎn)控制，更寬廣的抗原位點(diǎn)識(shí)別研究以及多種疫苗的相互聯(lián)用，都是今后值得關(guān)注的研究方向。

表1 ASF各種候選疫苗優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of various candidate vaccines for ASF