溶瘤病毒在腫瘤治療中的研究進展

黃慧雅，陸蔭英，謝 震

溶瘤病毒是指能通過不同的調控機制在腫瘤細胞內(nèi)復制進而裂解腫瘤細胞，但不影響正常細胞生長狀況的一類病毒。其在腫瘤細胞裂解的過程中會釋放腫瘤特異性抗原，進而激活機體特異性免疫反應。所以溶瘤病毒可以通過直接裂解和免疫作用兩種方式殺傷腫瘤細胞。溶瘤病毒在臨床上的應用最早可以追溯到19世紀末，一名患有白血病的42歲女子在一次疑似感染流感病毒后腫瘤忽然痊愈。1912年意大利醫(yī)生報道了一個晚期的宮頸癌患者在注射狂犬病疫苗后病情明顯緩解的案例。溶瘤病毒臨床研究和治療在20世紀50年代和70年代出現(xiàn)過短暫的熱潮，但由于溶瘤病毒易于被人體免疫系統(tǒng)清除而導致療效不能持續(xù)的缺點，之后經(jīng)歷了一段研究低迷期。至20世紀90年代，重組病毒基因組改造技術逐漸成熟，大大提高了溶瘤病毒在腫瘤治療方面的效果、特異性和安全性，一批抗腫瘤溶瘤病毒藥物陸續(xù)成功上市。2015年，美國FDA批準安進公司的溶瘤單純皰疹病毒talimogene laherparepvec（T-VEC）用于治療黑色素瘤。同年12月T-VEC又獲得歐盟批準用于治療未轉移至骨骼、腦部、肺部或其他臟器的不可切除的Ⅲb、Ⅲc、ⅣM1a期黑色素瘤。T-VEC的成功極大地推動了溶瘤病毒在腫瘤治療領域的研發(fā)。本篇總結了溶瘤病毒在腫瘤治療領域的最新研究進展，對溶瘤病毒種類變化、結構改進、參與腫瘤免疫治療的機制以及臨床應用現(xiàn)狀及未來發(fā)展等方面進行了詳細介紹，深入探討了合成生物學對優(yōu)化溶瘤病毒治療技術平臺的開發(fā)潛能。

1 溶瘤病毒的種類及研發(fā)現(xiàn)狀

目前應用于腫瘤臨床治療的溶瘤病毒種類很多，大致可以分為兩大類：一類是非基因編輯病毒，多為天然存在未經(jīng)基因編輯的病毒；另一類是經(jīng)過基因編輯改造，能夠特異性地在腫瘤細胞中包裝復制的病毒（表1）。

表1 溶瘤病毒抗腫瘤治療藥物信息匯總Table 1 Information summary of oncolytic viruses anti-tumor drug

1.1 非基因編輯型溶瘤病毒 非基因編輯病毒主要以M1病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒為代表[1]。M1病毒在動物實驗中對多種腫瘤有治療效果。通過尾靜脈將M1病毒注射到小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其顆粒主要集中在腫瘤組織，能有效抑制腫瘤生長。并且與抗癌藥物含纈酪肽蛋白抑制劑聯(lián)用可顯著增強M1病毒的抗腫瘤活性，增幅高達3600倍[2]。

呼腸孤病毒可以特異地在Ras信號通路激活的腫瘤細胞中包裝復制，且不影響人體正常細胞[3]，已被用于多種腫瘤的治療。多個臨床Ⅰ期和Ⅱ期的試驗結果顯示，呼腸孤病毒可以有效控制腫瘤細胞生長，并且在II期臨床試驗中幾乎未觀察到3～4級不良反應，患者出現(xiàn)最多的不良反應為發(fā)熱（約86%），還有部分患者表現(xiàn)出寒顫、肌痛、疼痛、疲勞和惡心等癥狀[4-8]。2017年，一項利用Reolysin治療晚期轉移性乳腺癌患者的臨床II期研究數(shù)據(jù)表明，在與紫杉醇聯(lián)用治療的患者中，總生存期從10.4個月延長到17.4個月，Reolysin獲得美國FDA快速通道批準用于轉移性乳腺癌聯(lián)合治療。作為一款可以通過靜脈注射的溶瘤病毒治療藥物，Reolysin的臨床應用對溶瘤病毒抗腫瘤藥物的研發(fā)具有里程碑式的意義。

新城疫病毒是感染禽類神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的病毒，可特異性的在哺乳動物的腫瘤細胞內(nèi)復制，同時產(chǎn)生抗腫瘤細胞因子而促進腫瘤細胞壞死。目前已經(jīng)應用于臨床試驗研究的代表性藥物，主要有PV701和NDV-HUJ[9-10]。腫瘤細胞由于缺乏干擾素介導的抗病毒反應，無法像正常細胞一樣清除病毒顆粒，而PV701可以特異性地在腫瘤細胞中復制進而裂解腫瘤細胞。2002年在一項靜脈注射PV701治療79例實體瘤患者的Ⅰ期臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，患者在第一次給藥后出現(xiàn)的流感樣癥狀隨著后續(xù)治療的延續(xù)，不良反應次數(shù)和反應程度均降低。在較高劑量水平時療效顯著，無進展生存時間為4～31個月。治療11個月后通過電子顯微鏡觀察1例患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)了PV701顆粒從腫瘤細胞膜釋放的證據(jù)；同時通過組織學檢查觀測到腫瘤組織中有明顯的T淋巴細胞、漿細胞浸潤[11]。在對11例惡性神經(jīng)性肉芽腫患者使用NDV-HUJ株治療的臨床試驗中，有1例患者在3個月內(nèi)病情得到完全緩解，其余患者均未出現(xiàn)惡化現(xiàn)象，也沒有嚴重的不良反應發(fā)生，在患者的尿、血液、唾液以及腫瘤切片上均能檢測到該病毒[9]。Schirrmacher等[12]開發(fā)了一種雙特異性抗CD28融合蛋白（bsHN-CD28），并將之與疫苗ATV-NDV連接。這種病毒修飾的自體腫瘤細胞疫苗在結腸癌患者肝轉移切除后的Ⅰ期治療中顯示出治療效果。在對14例晚期結直腸癌患者進行了以bsHN-CD 28為載體的ATV-NDV疫苗治療后無嚴重不良反應記錄。所有患者在5次治療中至少有1次表現(xiàn)出抗腫瘤的T細胞免疫反應。

1.2 基因編輯型溶瘤病毒 臨床試驗網(wǎng)站（www.clinicaltrials.gov）的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示腺病毒、單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）、痘病毒等可通過基因改造而廣泛應用于溶瘤病毒的抗腫瘤治療。

腺病毒作為溶瘤病毒藥物具有十分顯著的優(yōu)勢：①易于制備和純化產(chǎn)生較高的病毒滴度，最高可達到1010～1012pfu；②基因組長度為36 kb，易于進行基因改造；③腺病毒DNA不會整合到感染的細胞基因組中，安全性比較高；④可以感染除血細胞外的多數(shù)哺乳動物細胞。但腺病毒自身免疫原性比較高，人體內(nèi)存在腺病毒的中和抗體，溶瘤腺病毒只能通過瘤內(nèi)注射方式治療腫瘤，限制了其在臨床上的應用。

目前溶瘤腺病毒主要有以下幾種調控方式：①刪除E1A CR2區(qū)或E1B55K基因，通過互補腫瘤細胞的P53基因表達缺陷，調控腺病毒在腫瘤細胞中特異表達[13]；②利用腫瘤特異性啟動子調控E1A基因在腫瘤細胞中特異表達[14-16]；③通過基因編輯改造腺病毒衣殼蛋白結構，特異性識別腫瘤細胞表面受體實現(xiàn)對腫瘤細胞的特異性感染[17]。1987年Barker等[18]構建基因重組溶瘤腺病毒ONYX-015（d11520），并且通過瘤內(nèi)注射的方式嘗試治療頭頸癌、胰腺癌和再發(fā)性肉芽腫瘤等，臨床試驗中患者表現(xiàn)出感冒樣癥狀和局部注射疼痛，但沒有發(fā)現(xiàn)嚴重的不良反應。在頭頸癌的臨床試驗中，注射部位在注射后10 d內(nèi)可檢測到腺病毒DNA，但并未在周圍組織中觀測到病毒增殖。單用ONYX-015（d11520）治療客觀緩解率并不理想（＜20%），而聯(lián)用順鉑等化療藥物后客觀緩解率提高到63%[19-20]。安柯瑞是在中國獲批上市的人5型基因重組腺病毒，結構類似于ONYX-015（d11520），主要用于頭頸癌的治療[21]。CG7060和CG7870利用前列腺特異性抗原（prostate specific antigen,PSA）啟動子調控腺病毒E1A基因在前列腺癌細胞中特異性表達。在局部再發(fā)性前列腺癌的I期臨床試驗中，未發(fā)現(xiàn)受試者有嚴重的不良反應。聯(lián)用多西他賽，36%的患者PSA水平下降，27%的患者6個月內(nèi)觀測到無腫瘤進展，但之后的研究并沒有提供更好的結果[22]。由于腺病毒復制速度有限，并且人體內(nèi)存在大量腺病毒中和抗體，單獨依賴腺病毒的溶瘤作用治療腫瘤效果十分有限。大量研究嘗試通過利用溶瘤腺病毒表達免疫效應因子來提高抗癌效果，部分研究在小鼠實驗水平已經(jīng)取得了不錯的進展，目前處于臨床試驗的不同階段[23-25]。但由于目前溶瘤腺病毒的主要調控機制仍然以單一機制為主，在臨床可以觀測到病毒在正常組織泄露的現(xiàn)象。因此如何實現(xiàn)溶瘤腺病毒在臨床水平的嚴謹控制仍然是一個值得研究的重大課題。

2015年美國FDA批準T-VEC用于黑色素瘤的治療。T-VEC去除了HSV-1型的感染細胞蛋白（infected cell protein,ICP）34.5和ICP47，并可在腫瘤細胞內(nèi)特異表達集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor,GM-CSF），進而特異性殺傷腫瘤細胞。HSV-1作為溶瘤病毒有以下幾個特征：①可以感染包括血細胞在內(nèi)的大多數(shù)細胞；②不需要很高的感染復數(shù)就可以有效殺死腫瘤細胞；③基因組長152 kb，可攜帶較大片段外源基因[26]。HSV-1的ICP34.5可以與宿主的蛋白磷酸酶1結合，解除蛋白激酶R（protein kinase R,PKR）的抗病毒作用。在正常細胞中，缺失ICP34.5的HSV-1不能阻止磷酸化PKR的抗病毒作用，無法復制；而在腫瘤細胞中由于PKR含量低，病毒仍可復制[27]。除了去除ICP34.5因子，T-VEC還刪除了ICP47基因。ICP47特異結合與抗原加工相關的轉運蛋白，使外源肽無法與主要組織相容性復合物（major histocompability complex,MHC）I類分子結合，因此去除HSV-1的ICP47后，可以提高宿主免疫反應，增強對腫瘤的殺傷作用。另外，T-VEC還表達了GM-CSF，吸引樹突狀細胞（dendritic cell,DC）提高機體的抗腫瘤免疫反應[28]。除T-VEC外，處于不同階段臨床試驗的多種溶瘤HSV被廣泛應用于腫瘤治療中，如惡性腦膠質腫瘤、乳腺癌、大腸癌、直腸癌、前列腺癌、頭頸癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、肝癌及惡性黑色素瘤等[29-32]。

JX-594（也稱為Pexa-Vec）是由托馬斯杰斐遜大學的Edmund Lattime博士實驗室構建的溶瘤痘病毒，由SillaJen公司進一步開發(fā)，隨后在黑色素瘤患者中進行臨床研究[33]。由于缺失胸苷激酶基因，JX-594可以在高水平表達胸苷激酶如具有RAS或P53基因突變的癌細胞中表達復制，但不會對正常細胞產(chǎn)生影響。同時，JX-594可在腫瘤細胞中表達GM-CSF，引發(fā)機體抗腫瘤免疫反應。

在一項針對轉移性黑色素瘤的臨床試驗中，7例瘤內(nèi)注射JX-594病毒的患者中未被觀察到嚴重的不良反應。2號和6號患者因為腫瘤過大未響應病毒治療。另外5例（71%）腫瘤出現(xiàn)明顯反應，其中1、4、5號患者的病毒注射部位腫瘤和遠端腫瘤都有響應；3號通過聯(lián)合外科手術切除腫瘤后完全治愈；7號患者完全響應，注射部位腫瘤和遠端腫瘤完全消失。所有患者的腫瘤組織中都可以檢測到GM-CSF表達，T細胞和B細胞浸潤。3號患者7個月后仍能在腫瘤組織中檢測出病毒[33]。Cripe等[34]在5例兒科患者中進行了多達3個腫瘤部位的一次性注射JX594（每千克腫瘤重量對應106～107pfu的病毒）的臨床試驗，入組患者的年齡為4～21歲，他們的癌癥診斷包括神經(jīng)母細胞瘤，肝細胞癌和尤文肉瘤等，所有患者毒性反應均≤3級，最常見的不良反應是鼻竇發(fā)熱和竇性心動過速；高劑量組共3例患者，均出現(xiàn)無癥狀的1級治療相關皮膚膿皰，并在3～4周內(nèi)消退，1例患者的影像學檢測數(shù)據(jù)證實了病毒抗腫瘤生物活性：磁共振成像顯示注射病毒后腫瘤組織出現(xiàn)壞死變化，以及在首次注射病毒后第22 d正電子發(fā)射斷層掃描的標準攝取值下降。這項研究證實JX594通過腫瘤內(nèi)給藥對兒科患者的安全性，并且可以在該患者群體中展開進一步研究。截至2018年6月JX594已有多項單獨或聯(lián)合治療臨床試驗在肝細胞癌、實體瘤、腎癌和結直腸癌的治療試驗中進行。

2 溶瘤病毒高效參與腫瘤免疫治療

有效的免疫治療依賴于腫瘤微環(huán)境中的免疫反應，主要涉及以下幾個方面：①高密度的腫瘤浸潤細胞（tumor-in filtrating lymphocytes,TIL）可以保證較強的腫瘤免疫殺傷作用；②浸潤淋巴細胞有效識別腫瘤特異性抗原；③解除腫瘤微環(huán)境中對腫瘤免疫治療的抑制作用[35-37]。腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞組成了復雜的腫瘤微環(huán)境，主要包括以下幾個區(qū)域：有豐富TIL浸潤的免疫浸潤區(qū)，完全沒有免疫細胞浸潤的免疫荒蕪區(qū)和有部分免疫細胞浸潤的免疫排斥區(qū)。將TIL高效募集到腫瘤微環(huán)境，同時阻斷免疫抑制途徑是保證免疫治療效果的關鍵因素。

溶瘤病毒可以參與腫瘤免疫治療的多個階段（圖1），有效招募淋巴細胞在腫瘤微環(huán)境富集：①直接裂解腫瘤細胞，進而釋放腫瘤特異性抗原和免疫相關因子，誘發(fā)機體產(chǎn)生系統(tǒng)的抗腫瘤免疫反應；②表達外源治療基因，吸引淋巴細胞在腫瘤微環(huán)境中的募集；③通過交叉提呈感染腫瘤細胞作為新抗原疫苗原位源，促使機體產(chǎn)生特異的抗腫瘤免疫反應，進而殺傷遠端未受感染的腫瘤細胞[38]。

圖1 溶瘤病毒參與腫瘤細胞殺傷的途徑Figure 1 Oncolytic viruses affect multiple key steps in cancer immunity therapy

2.1 溶瘤病毒參與腫瘤免疫反應的途徑 溶瘤病毒通過參與多種腫瘤進展相關機制、介導機體抗腫瘤免疫過程，發(fā)揮抗腫瘤活性。首先，溶瘤病毒可通過溶瘤作用直接殺死腫瘤細胞，導致可溶性腫瘤相關抗原釋放，這些分子募集并激活抗原呈遞細胞，如BATF3+DC。BATF3+DC吞噬可溶性腫瘤抗原并遷移至區(qū)域性淋巴結，進而引發(fā)針對腫瘤的適應性T細胞應答[39]。其次，病毒介導的干擾素和趨化因子表達釋放導致抗原加工和表達因子水平增加如MHC I類分子的表達，同時加強腫瘤特異性浸潤CD8+T細胞的募集，這些細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxicity T lymphocytes,CTLs）識別并殺死腫瘤細胞，遠端位點的腫瘤細胞也是CTLs的靶標[40]。同時干擾素的反調節(jié)作用可以增加免疫檢查點的表達如程序性細胞死亡配體1，細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4）和半乳凝集素9，使得腫瘤經(jīng)過溶瘤病毒治療后更容易響應免疫檢查點阻斷藥物的治療[41]。

2.2 溶瘤病毒治療引發(fā)腫瘤微環(huán)境免疫反應 正常細胞具有比較完整的抗病毒機制，其可以通過環(huán)裝GMP-AMP合成酶-干擾素基因刺激因子系統(tǒng)或者其他因子如PKR，NLRP3，干擾素-γ誘導蛋白16和寡腺苷酸合成酶等識別DNA病毒；通過維甲酸誘導基因，黑色素瘤分化相關蛋白5，Toll樣受體3和7識別RNA病毒；這些識別因子可以促進干擾素-I表達介導病毒清除，增強 MHC I類分子表達和募集固有淋巴細胞。導致溶瘤病毒很難在正常細胞中復制包裝。而腫瘤細胞中則普遍缺失抗病毒功能，因此溶瘤病毒可以在腫瘤細胞中順利的復制包裝[42-43]。另外，腫瘤細胞更容易受到病毒溶瘤作用的影響，從而導致局部釋放病毒來源的病原體相關分子模式、細胞衍生的損傷相關分子模式以及干擾素-I，以誘導抗原遞呈增加， MHC I類分子表達，BATF3+DC細胞募集，先天淋巴細胞和腫瘤特異性T淋巴細胞浸潤等抗病毒免疫反應，而這些反應都是通過溶瘤病毒裂解腫瘤細胞釋放的病毒及腫瘤特異性抗原的遞呈引起的。所以溶瘤病毒具有增強新抗原遞呈和腫瘤特異性T淋巴細胞浸潤的雙重抗腫瘤免疫效應[44]。

3 溶瘤病毒聯(lián)合靶向藥物增效腫瘤治療

溶瘤病毒在腫瘤治療過程中的多功能特性使其具有與其他藥物聯(lián)用增效的巨大潛力。與化學治療藥物順鉑、5 -氟尿嘧啶和ONYX–015聯(lián)用，客觀緩解率可達65%，相較于單獨使用ONYX-015的15%的反應率有了顯著提高[20]。在一項三陰性乳腺癌的臨床前研究模型中，溶瘤馬拉巴病毒可以提高難治性腫瘤對免疫檢查點抑制劑的敏感性[45]。T-VEC（瘤內(nèi)注射）與CTLA4抗體ipilimumab（靜脈注射）聯(lián)用治療晚期黑色素瘤的客觀緩解率為50%，其中44%患者的有效率持續(xù)6個月以上，并且沒有觀察到劑量限制性毒性。另外在一項針對黑色素瘤患者的I期臨床研究中，對21例患者聯(lián)合應用T-VEC和PD1 單克隆抗體 pembrolizumab治療的結果顯示，患者的客觀緩解率為62%，完全緩解率為33%。另外，在聯(lián)合ipilimumab與T-VEC的一項Ib期臨床試驗中，19例患者均未發(fā)現(xiàn)劑量限制性毒性，但3～4級不良反應的發(fā)生率為26.3%，其中15.8%為T-VEC相關，21.1%為ipilimumab相關，客觀緩解率為50%，44%的患者有超過6個月的持續(xù)響應，18個月無進展生存率為50%，18個月總生存率為67%。T-VEC與ipilimumab聯(lián)合用藥具有較好的安全性，治療效果明顯優(yōu)于T-VEC或ipilimumab的單藥治療[46]。另外，部分研究已經(jīng)表明溶瘤病毒與放射性療法和細胞治療聯(lián)合也可以提高治療效果[47-51]。

盡管有溶瘤病毒的聯(lián)合治療方案已經(jīng)表現(xiàn)出了良好的臨床應用前景，但治療細節(jié)還需要大量的研究進行探索，比如不同療法組合方式、劑量選擇、順序選擇以及時間選擇等。同時不同溶瘤病毒免疫聯(lián)用療法適用患者的選擇標準以及療法評價時間點的確定都有待深入研究。

4 總結與展望

溶瘤病毒種類多、調控手段多樣、可以作為載體表達不同功能的外源基因，這些是溶瘤病毒治療腫瘤的優(yōu)勢。另外，溶瘤病毒可以整合到腫瘤免疫治療的多個環(huán)節(jié)，募集腫瘤浸潤淋巴細胞以及增強腫瘤新抗原遞呈引起的腫瘤特異性免疫反應等特性為溶瘤病毒聯(lián)用其他療法奠定了基礎。大量的臨床研究結果已經(jīng)顯示了溶瘤病毒療法尤其溶瘤病毒聯(lián)用療法在腫瘤治療領域良好的應用前景。

但溶瘤病毒療法仍然存在著很多須要解決的問題，這些問題是未來溶瘤病毒大規(guī)模應用要面對的挑戰(zhàn)。首先從病毒選擇和調控機制角度來講，現(xiàn)有的溶瘤病毒的調控機制較為單一，無法精準識別腫瘤細胞，由此造成的脫靶效應所引起的不良反應會嚴重影響腫瘤的治療效果。合成生物學以工程化的設計理念，構建標準化的元器件和模塊，搭建邏輯線路，改造天然存在的生命體如細菌、真菌和細胞等，實現(xiàn)特殊的生理功能[52]。人們利用合成生物學手段對生命系統(tǒng)進行編輯，可以實現(xiàn)對生命系統(tǒng)的精準調控。利用合成生物學手段設計構建系統(tǒng)的分子開關，調控溶瘤病毒在腫瘤細胞中的復制，通過多水平、多輸入信號的應用提高溶瘤病毒安全性的最優(yōu)路徑。其次，溶瘤病毒、腫瘤細胞微環(huán)境和免疫系統(tǒng)共同構成的復雜系統(tǒng)對溶瘤病毒療法的療效起著決定性作用。通過生物信息學手段分析治療過程中三者的相互關系，確定溶瘤病毒的有效劑量和給藥方式可以保證腫瘤治療的效果。此外，在聯(lián)用其他藥物方面，最佳的病毒、聯(lián)用方法藥物劑量的選擇，以及治療順序與時間等都須要進一步地研究。再者，環(huán)境、飲食和宿主自生腸道微生物菌群等如何參與影響溶瘤病毒治療過程也是一個值得深入探討的科學問題?？傊芰霾《镜亩鄻有?、可編輯性和多效性使它成為優(yōu)化聯(lián)合免疫治療的理想平臺。