補陽還五湯對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障保護作用的研究

劉建春 ，張紅珍 ，郭文娟 ，柴 智 ，尉杰忠 ，于婧文 ，肖保國 ，馬存根 ，

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西晉中030619； 2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西大同 037009；3.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海200025）

多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的自身免疫性疾?。?］，其主要病理特征為髓鞘脫失、軸突變性及炎性細胞浸潤?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對MS的治療手段主要包括抗炎和免疫調(diào)節(jié)兩方面，然而MS病程遷延、病情反復(fù)發(fā)作，多不能得到有效的控制，且有些藥物不良反應(yīng)較大［1-2］。中醫(yī)藥在治療MS方面以多靶點、整體調(diào)節(jié)為切入點，可能比單一作用靶點的西藥更具優(yōu)勢［3］。在臨床上，應(yīng)用中醫(yī)藥的方法治療MS一方面可改善患者臨床癥狀、減緩疾病的復(fù)發(fā)，另一方面還可減少激素不良反應(yīng)等［4］。

中醫(yī)認為，MS基本病機是本虛標(biāo)實，血瘀是其中較為特殊的一個證候要素［5］。氣虛血瘀證為常見證型之一，治療應(yīng)以補氣，活血，祛痰、濕、瘀，通絡(luò)為主。清代著名醫(yī)家王清任所創(chuàng)的補陽還五湯（BYHWD）是益氣活血的代表方劑，具有補氣活血通絡(luò)之功效，由生黃芪四兩、當(dāng)歸尾二錢，赤芍一錢半，川芎一錢，地龍一錢，桃仁一錢，紅花一錢組成［6-8］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BYHWD治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）可明顯改善臨床癥狀，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫［9］。本研究以 MS的經(jīng)典動物模型EAE小鼠為研究對象，進一步探討補陽還五湯在疾病潛伏期、發(fā)病高峰期、疾病緩解期這3個時間點對EAE的血腦屏障（BBB）保護的機制，以期為臨床有效防治多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6雌性小鼠，8～10 w齡，共36只，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］。實驗前小鼠自由飲食喂養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)環(huán)境為25℃左右的無病原菌清潔級動物房。

1.1.2 實驗藥物 補陽還五湯為《醫(yī)林改錯》的原方劑量，藥材購自北京同仁堂藥店。弗氏佐劑（Freund，sAdjuvant，Complete） 購自美國 Sigma 公司；上海強耀生物科技有限公司合成的MOG 35-55多肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide）；Tuberculosis bacilli（TB）購自美國DIFCO公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自BioVision。ZO-1，Occludin均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。凝膠電泳設(shè)備，北京六一儀器廠產(chǎn)品，凝膠成像分析儀購自Bio-Rad，冰凍LEICA切片機，CM1950，購自德國LEICA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EAE小鼠模型建立 分別稱取12 mg TB加入2 mL完全弗氏佐劑，稱取10 mg MOG35-55加入2 mL生理鹽水中；采用自制的針管混合器來回反復(fù)推動使兩種溶液充分混合，制成油包水樣乳白色抗原乳劑。每只小鼠分4點皮下注射抗原乳劑0.1 mL，注射位置在背側(cè)腰骶膨大處背部中線兩側(cè)［10］。將免疫當(dāng)天記為免疫后第0天。在免疫當(dāng)日和免疫后第2天，分別給每只小鼠腹腔注射百日咳毒素（PTX）300 ng。免疫動物開始相繼出現(xiàn)臨床癥狀是在免疫后的第10天左右，在14～17 d進入高峰期，本次實驗小鼠全部發(fā)病，且無死亡［11］。

1.2.2 補陽還五湯的制備 藥物按常規(guī)中藥煎煮方法，藥物在水中浸泡2 h，煎煮1 h，紗布過濾，渣滓再加適量水煎煮30 min，過濾，二次濾液合并，靜置過夜；次日將藥液沉淀過濾掉，將濾液濃縮至80 mL，相當(dāng)于生藥2 g/mL，常溫下冷卻，分裝，4℃冷藏備用。

1.2.3 動物分組及用藥 應(yīng)用隨機數(shù)字表按體質(zhì)量分層，將36只8～10 w齡雌性C57BL/6小鼠隨機分為EAE組、BYHWD組，每組18只。每組小鼠于免疫后第3天開始灌胃給藥，EAE組每只小鼠灌胃生理鹽水500 μL/d，BYHWD組每只小鼠予以BYHWD 500 μL/d，持續(xù)給藥至免疫 28 d。

1.2.4 EAE臨床癥狀評分 采用國際通用的5分法［12］，在免疫后第0天開始隔天定時觀察及評估實驗小鼠的癥狀，評估標(biāo)準(zhǔn)為：無任何臨床癥狀記0分；輕度步態(tài)笨拙，尾部張力消失記 1分；步態(tài)蹣跚，單側(cè)后下肢無力，被動翻身后仍可以復(fù)位記2分；雙后肢癱瘓，但給予刺激后可以挪動，被動翻身后不能恢復(fù)記3分；前肢和雙側(cè)后肢癱瘓記4分；瀕臨死亡或死亡記5分。癥狀介于兩個評分標(biāo)準(zhǔn)之間，以±0.5 分計。

1.2.5 標(biāo)本采集 將免疫后第9天記為疾病潛伏期，第17天記為發(fā)病高峰期，第28天記為緩解期。在免疫后第9天、第17天、第28天3個不同時間點分別隨機取EAE組和BYHWD組6只小鼠，采用 10%水合氯醛（0.2 mL/只）腹腔注射麻醉，每組取3只推注PBS進行心臟灌注，同時在冰上快速取小鼠脊髓和腦組織，冰上裂解，4℃離心提取蛋白，凍存。各組其余3只小鼠推注PBS至肝臟發(fā)白，再推注4%多聚甲醛進行體內(nèi)組織固定。然后分離脊髓和腦，制作冷凍切片，冰切厚度10 μm，進行固藍染色和HE染色。

1.2.6 HE染色 將脊髓冰凍切片在蒸餾水中浸潤，按照說明書在切片上分別滴加蘇木精和伊紅染色，梯度乙醇脫水，70%乙醇中 30 s，80%乙醇中 30 s，90%乙醇中 30 s，95%乙醇中 30 s，100%乙醇中 1 min，100%乙醇中 2 min；二甲苯透明，用中性樹膠封片，鏡檢，拍照。

1.2.7 固藍染色 取脊髓切片于 95% 乙醇中浸泡，按照說明書的操作步驟，將切片浸于固藍液中，57℃ 孵育24 h，分別經(jīng)過乙醇溶液、去離子水、0.05%碳酸鋰浸洗直至能夠清晰辨別灰質(zhì)與白質(zhì)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光鏡下觀察，拍照。

1.2.8 Western Blot 分別提取脊髓和腦組織蛋白，蛋白定量后，加入Buffer煮蛋白，用微量加樣器加入40 μg煮好的蛋白樣品。用 10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白。電泳完畢后，濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗一抗ZO-1（1∶500）、Occludin（1∶1000）、GADPH（1∶1000），4℃過夜；次日洗滌后，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP 標(biāo)記二抗（1∶50 000）稀釋，使 PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，37℃搖床室溫孵育2 h。洗膜后進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用Bio-RAD凝膠成像儀檢測條帶，用Band Scan分析灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值比較，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graph Pad Prism5.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，Western blot灰度值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較使用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAE組和BYHWD組臨床癥狀比較

EAE組小鼠自免疫后第9天起逐步發(fā)病，精神萎靡、食欲減退，平均起病時間（10.6±1.32）d，平均最高臨床評分為（3.4±0.22）分。免疫后 17 d 發(fā)展為臀部拖地，后肢癱瘓，此時，最高臨床癥狀評分可達 4.5分。補陽還五湯組平均起病時間（12.6±0.7）d，臨床癥狀評分為（1.55±0.39）分。兩組平均起病時間比較，t=3.45，P=0.003 2，補陽還五湯可明顯延遲發(fā)??；兩組平均最高臨床評分比較，t=14，P=0.000 1，補陽還五湯可明顯延遲發(fā)病，降低EAE臨床評分。結(jié)果見圖1。

2.2 EAE組和BYHWD組脊髓炎性細胞浸潤和髓鞘脫失情況比較

2.2.1 HE染色 BYHWD抑制脊髓炎性細胞浸潤。在EAE疾病潛伏期：EAE組9 d小鼠的脊髓組織中發(fā)現(xiàn)少數(shù)炎細胞浸潤；BYHWD組9 d小鼠的脊髓組織中無炎細胞浸潤。在EAE發(fā)病高峰期：EAE組17 d小鼠的脊髓組織中出現(xiàn)大量炎細胞浸潤；BYHWD組17 d小鼠的脊髓切面結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎細胞浸潤。在EAE發(fā)病緩解期：EAE組28 d小鼠的脊髓組織中炎細胞浸潤減少；BYHWD組28 d小鼠的脊髓組織中無明顯炎細胞浸潤。結(jié)果見圖2。

圖2 免疫后第9天、第17天和第28天脊髓HE染色

2.2.2 LFB染色 BYHWD可減少脊髓的髓鞘脫失面積。疾病潛伏期：EAE9 d組中小鼠的脊髓白質(zhì)較BYHWD9 d組結(jié)構(gòu)疏松；發(fā)病高峰期和發(fā)病緩解期：分別EAE17 d組、EAE28 d組比較，BYHWD17 d組、BYHWD28 d組小鼠的脊髓白質(zhì)中髓鞘脫失面積較少。結(jié)果見圖3。

2.2.3 EAE組和 BYHWD組緊密連接蛋白表達比較 Western Blot法檢測小鼠脊髓和腦中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達，結(jié)果顯示，與對應(yīng)的EAE17 d和EAE28 d相比較，BYHWD9 d、17 d和28 d ZO-1在脊髓和腦中表達量均明顯上調(diào)（P＜0.001）（圖 4、圖 5）；與對應(yīng)的 EAE9 d、EAE17 d和 EAE28 d相比較，BYHWD9 d、17 d和 28 d Occludin 在脊髓中表達量均明顯上調(diào)（P＜0.001），與對應(yīng)的EAE9 d、EAE17 d組小鼠比較，BYHWD9 d、BYHWD17 d在腦中 Occludin 高表達（P＜0.001），BYHWD28 d組與EAE28 d組比較表達增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖4、圖5。

圖3 免疫后第9天、第17天和第28天脊髓LFB染色

圖4 EAE組和BYHWD組緊密連接蛋白在脊髓的表達

3 討論

血液和腦組織之間存在血腦屏障（Blood brain barrier，BBB），其由腦毛細血管內(nèi)皮細胞、基膜和星形膠質(zhì)細胞突起的腳板構(gòu)成［13］。腦的毛細血管屬連續(xù)毛細血管，內(nèi)皮細胞之間有緊密連接，可以阻止血液中的一些物質(zhì)轉(zhuǎn)運到中樞，從而保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［14］。因此，維持BBB結(jié)構(gòu)的完整性是嚴(yán)格控制大腦化學(xué)成分的關(guān)鍵，是神經(jīng)組織發(fā)揮正常功能的重要前提之一。BBB的破壞導(dǎo)致毛細血管通透性增加，使血源中有毒的分子、細胞和微生物制劑進入大腦，它能啟動多種神經(jīng)變性途徑［15-16］。

圖5 EAE組和BYHWD組緊密連接蛋白在腦的表達

多發(fā)性硬化（MS）是一種由 CD4+T淋巴細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘疾病。BBB完整性的破壞在 MS/EAE發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。目前已證實，在MS患者腦中除了外周血巨噬細胞浸潤外，還發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞和B淋巴細胞的大量涌入，這表明BBB的破壞使得循環(huán)血液中炎性細胞穿過BBB浸潤到中樞神經(jīng)系統(tǒng)［17］，導(dǎo)致了一系列免疫反應(yīng)，破壞神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞，造成局部脫髓鞘和神經(jīng)變性［1，18］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，EAE9 d小鼠的脊髓組織中發(fā)現(xiàn)少數(shù)炎細胞浸潤，說明在EAE發(fā)病的最早階段就有BBB通透性增加，在EAE發(fā)病高峰期17 d小鼠的脊髓組織中出現(xiàn)大量炎細胞浸潤，而BYHWD17 d組小鼠的脊髓切面結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎細胞浸潤。與 EAE17 d、EAE28 d 比較，BYHWD17 d、BYHWD28 d組小鼠的脊髓白質(zhì)中髓鞘脫失面積較少。這些結(jié)果說明BYHWD可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細胞浸潤，減輕髓鞘脫失。

腦血管內(nèi)皮細胞及其細胞之間的緊密連接是保持血腦屏障的重要因素［19］。緊密連接蛋白主要包括胞質(zhì)蛋白 ZO-1和跨膜蛋白 Occludin、Claudins等。其中，ZO-1是非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在緊密連接中起著重要的連接樞紐作用，它將跨膜蛋白與細胞骨架、結(jié)構(gòu)蛋白聯(lián)系；ZO-1表達水平及活性的高低與緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和細胞功能的完整性密切相關(guān)，ZO-1表達水平的高低可以作為BBB功能的標(biāo)志［14-15］。體外、體內(nèi)動物模型和患者組織研究的觀察結(jié)果表明，在MS病理學(xué)中，血腦屏障完整性和功能的破壞程度很高［20］。與正常結(jié)構(gòu)的白質(zhì)相比，在MS病變中，內(nèi)皮變性，緊密連接蛋白ZO-1不連續(xù)地表達［21］。本實驗結(jié)果顯示，與對應(yīng)的EAE9 d、17 d和 28 d相比較，BYHWD 9 d、17 d和 28 d組，ZO-1 在脊髓和腦中表達量均顯著上調(diào)，Occluudin在脊髓中表達量均顯著上調(diào)，表明BYHWD在EAE疾病潛伏期、疾病高峰期和緩解期能通過上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1和Occluudin的表達，抑制血腦屏障的破壞，抑制中樞炎性浸潤，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。