烏蘇里瓦韋對(duì)小鼠鎮(zhèn)咳、祛痰作用研究

譚靜，林紅強(qiáng)，吳福林，鄭炳真，董慶海，李平亞，劉金平，王涵

（吉林大學(xué)藥學(xué)院天然藥物研究中心，長春 130021）

烏蘇里瓦韋為蕨類水龍骨科（Polypodiaceae）瓦韋屬（Lepisorus）植物烏蘇里瓦韋〔Lepisorus ussuriensis（Regel et Maack）Ching〕的干燥全草，別名騸雞尾、石茶、樹茶、鐵包針、劍刀草、大石韋等，主要分布于吉林省、黑龍江省、安徽省、河南省、山東省、河北省、遼寧省等海拔750～1 700 m地區(qū)，附生林下或山坡陰處，野生資源較為豐富[1]。烏蘇里瓦韋富含黃酮類、皂苷類、有機(jī)酸類及甾體類等成分[2]，綠原酸、葉黃素、蛻皮甾酮和黃酮類物質(zhì)是其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。烏蘇里瓦韋味苦、性平、無毒，具有清熱解毒、利尿、止血、消腫等功效[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其有抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化等活性[5-6]。民間廣泛用于治療小便不利、小便淋痛、水腫、尿血、咽喉腫痛、濕熱痢疾、瘡瘍腫毒、刀傷出血等多種病癥，也將其制成茶葉用于治療各種炎癥疼痛[7-9]。

為進(jìn)一步開發(fā)利用該藥用植物，本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了活性篩選。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，烏蘇里瓦韋抗小鼠耳廓腫脹活性的藥效物質(zhì)可能是黃酮類以及酚酸類物質(zhì)[10]，故本課題組以95%乙醇進(jìn)行回流提取，獲得了含量較高的總黃酮和總酚酸類物質(zhì)，并首次通過氨水引咳和酚紅排泌等經(jīng)典模型研究了烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物的鎮(zhèn)咳和祛痰作用，繼而采用氣管注射脂多糖（LPS）造成急性呼吸道炎癥模型以探討提取物是否通過抗炎機(jī)制而發(fā)揮藥理作用。

1 材料、儀器

1.1 材料

烏蘇里瓦韋采于吉林省磐石市煙筒山鎮(zhèn)和平屯東山，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院李平亞教授鑒定為蕨類水龍骨科植物烏蘇里瓦韋（L.ussuriensis）的全草，存放于吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所新藥研發(fā)標(biāo)本室。烏蘇里瓦韋95%乙醇回流提取物由本實(shí)驗(yàn)室自制，紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定物質(zhì)含量，其中，總黃酮15.8%、總酚酸8.7%。試驗(yàn)前，用純凈水配制成0.16g/mL、0.08g/mL、0.04g/mL的溶液。

SPF 級(jí)ICR 小鼠130 只，雌、雄各半，（20±2）g，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：SCXK（吉）-2016-003。室溫22 ℃～24 ℃、相對(duì)濕度55%～65%環(huán)境中飼養(yǎng)，自由采食飲水。

枸櫞酸噴托維林片（國藥準(zhǔn)字號(hào)：H12020234，批號(hào)：1611014，天津力生制藥股份有限公司，灌胃前用純凈水制成2.5 mg/mL 的溶液）；脂多糖（LPS，批號(hào)：O0808A，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；腫瘤壞死因子-（TNF-）ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：201802，上海諾淵生物科技有限公司）；小鼠白細(xì)胞介素1（IL-1 ）和小鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20171220-4812，武漢華德試劑有限公司）。

碳酸氫鈉（NaHCO3，批號(hào)：20180110，北京化工廠）；酚紅（批號(hào)：C10115997，上海麥克林生化科技有限公司）；氨水（批號(hào)：171008001，西隴科學(xué)股份有限公司）；10%水合氯醛（批號(hào)：20150312，沈陽市試劑三廠）。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器

FA1104N 電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16-aR 高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；722 紫外-可見分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；BIO-RAD酶標(biāo)儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對(duì)氨水引咳模型小鼠的影響

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，放入鐘罩內(nèi)，再將重量、形狀基本一致的棉球放入鐘罩內(nèi)，迅速向棉球中注入1.0 mL 25%的濃氨水，密閉20 s 后取出小鼠，以小鼠抬頭、張嘴并伴有腹肌收縮等咳嗽動(dòng)作者即為咳嗽1次[11]。從取出小鼠后開始計(jì)時(shí)，記錄小鼠的咳嗽潛伏期和3 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)，剔除3 min 內(nèi)不咳嗽的老鼠[12-13]。

將挑選好的50 只小鼠按性別、體重隨機(jī)分為5 組，即空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組（枸櫞酸噴托維林25 mg/kg）、烏蘇里瓦韋高劑量組（1.6 g/kg）、烏蘇里瓦韋中劑量組（0.8 g/kg）、烏蘇里瓦韋低劑量組（0.4 g/kg），每組10 只。各組小鼠灌胃給藥（10 mL/kg），空白對(duì)照組灌胃給予純凈水，連續(xù)給藥7 d，每天灌胃給藥1 次。末次給藥1 h 后，按上述方法測(cè)定小鼠的咳嗽潛伏期和3 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)[14]。

2.2 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對(duì)小鼠氣管段酚紅排泌的影響

準(zhǔn)確稱取10 mg 酚紅，加5%NaHCO3 溶液100 mL溶解，依次稀釋為0.1g/mL、0.3g/mL、0.5g/mL、0.7g/mL、1.0g/mL、3.0g/mL、5.0g/mL、7.0g/mL、10.0g/mL 的溶液，546 nm 處測(cè)定吸光度[15]，以酚紅濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.126X+0.037 7（r2=0.999 3）。

ICR 小鼠50 只，雌、雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，分組、給藥同“2.1”項(xiàng)下方法。末次給藥1h 后，每只小鼠腹腔注射（20 mL/kg）2.5%酚紅生理鹽水溶液，注射30 min后脫頸椎處死小鼠，鈍性剖離氣管周圍組織及食道，充分暴露出氣管，用止血鉗夾住自甲狀軟骨至氣管分叉處的氣管兩端，防止氣管內(nèi)的液體流出。將氣管剪下后，用生理鹽水清洗氣管表面殘留的血液，加0.5%NaHCO3溶液2mL，超聲10min，3000r/min離心5 min，取上清液于546 nm 處測(cè)定吸光度值[11]。

2.3 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對(duì)急性炎癥小鼠IL-6、IL-1及TNF-的影響[16]

ICR小鼠30 只，雌、雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、烏蘇里瓦韋高劑量組（1.6g/kg）3 組。各組小鼠均連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥1 h 后，各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛（5mL/kg）麻醉。正常對(duì)照組小鼠麻醉后不作處理，給藥組和模型組小鼠仰臥位固定，用鑷子捏起頸部皮膚，于頸正中線剪一小口，暴露皮下組織，用無菌棉棒鈍性分離頸部軟組織和肌肉，露出氣管，向氣管內(nèi)緩緩注入LPS 溶液100L（10 mg/Kg），隨后立即豎立小鼠，并旋轉(zhuǎn)體位以便于LPS 溶液在肺內(nèi)進(jìn)行全面的分布，創(chuàng)口縫合，碘伏消毒；2 h 后，小鼠眼眶取血，3 000 r/min（4 ℃）離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書方法測(cè)定血清中IL-6、IL-1 及TNF-的含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對(duì)氨水引咳模型小鼠的影響

與空白對(duì)照組比較，烏蘇里瓦韋提取物高、中劑量組的咳嗽潛伏期明顯延長，咳嗽次數(shù)明顯減少（P ＜0.01，P＜0.05），與陽性藥枸櫞酸噴托維林具有類似的作用；烏蘇里瓦韋提取物低劑量組未見明顯作用。見表1。

表1 烏蘇里瓦韋對(duì)小鼠氨水引咳潛伏期和咳嗽次數(shù)的影響Table 1 Effects of L.ussuriensis on the mice ammonia induced cough latency and cough times （n=10，±s）

表1 烏蘇里瓦韋對(duì)小鼠氨水引咳潛伏期和咳嗽次數(shù)的影響Table 1 Effects of L.ussuriensis on the mice ammonia induced cough latency and cough times （n=10，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*.P ＜0.05；**.P ＜0.01。下表同。Note:Compared with the blank control group,*.P ＜0.05;**.P ＜0.01.The table below is the same.

組別Group name劑量Dose引咳潛伏期（s）Coughing latency咳嗽次數(shù)Cough times空白對(duì)照組 Blank control group - 2.62±0.89 29.80±18.98枸櫞酸噴托維林組 Pentoxyverine group 25mg/kg 4.29±1.46** 12.40±2.50**烏蘇里瓦韋高劑量組 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 6.05±3.26** 11.20±6.01**烏蘇里瓦韋中劑量組 L.ussuriensis medium dose group 0.8g/kg 4.12±2.04* 16.60±5.58*烏蘇里瓦韋低劑量組 L.ussuriensis low dose group 0.4g/kg 2.16±1.08 35.80±16.86

3.2 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對(duì)小鼠氣管段酚紅排泌的影響

隨著小鼠氣管內(nèi)分泌的粘液增加，氣管內(nèi)的酚紅排泌量也增多[15]。與空白對(duì)照組比較，烏蘇里瓦韋高、中劑量組可使小鼠氣管酚紅排泌量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 烏蘇里瓦韋對(duì)小鼠氣管段酚紅排泌的影響Table 2 Effects of L.ussuriensis on phenol red secretion in mice tracheal segments （n=10，±s）

表2 烏蘇里瓦韋對(duì)小鼠氣管段酚紅排泌的影響Table 2 Effects of L.ussuriensis on phenol red secretion in mice tracheal segments （n=10，±s）

組別 Group name 劑量Dose酚紅排泌量（ g/mL）Phenol red excretion空白對(duì)照組 Blank control group - 0.37±0.13枸櫞酸噴托維林組 Pentoxyverine group 25mg/kg 0.55±0.17*烏蘇里瓦韋高劑量組 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 0.56±0.25*烏蘇里瓦韋中劑量組 L.ussuriensis medium dose group 0.8g/kg 0.49±0.11*烏蘇里瓦韋低劑量組 L.ussuriensis low dose group 0.4g/kg 0.45±0.17

3.3 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對(duì)小鼠IL-6、IL-1及TNF-的影響

炎癥反應(yīng)是當(dāng)機(jī)體受到外界損傷或致炎因素刺激時(shí)，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞被激活，在受損部位大量聚集，產(chǎn)生一系列的炎性細(xì)胞因子，包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 和TNF-等[17-18]，其中，最為主要的促炎因子有IL-6、IL-1和TNF-等。

將LPS 注入氣管內(nèi)后，與正常對(duì)照組比較，模型組血清中IL-6、IL-1及TNF-的含量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），表明小鼠急性炎癥模型造模成功。

表3 烏蘇里瓦韋對(duì)小鼠IL-6、IL-1 及TNF- 的影響Table 3 Effects of L.ussuriensis on IL-6,IL-1 and TNF- in mice （n=10，±s）

表3 烏蘇里瓦韋對(duì)小鼠IL-6、IL-1 及TNF- 的影響Table 3 Effects of L.ussuriensis on IL-6,IL-1 and TNF- in mice （n=10，±s）

組別 Group name 劑量 Dose IL-6 IL-1 TNF-空白對(duì)照組 Blank control group - 8.95±1.36 11.16±1.82 58.54±3.14模型對(duì)照組 Model control group - 11.49±1.15** 12.80±2.41** 105.86±28.04**烏蘇里瓦韋高劑量組 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 10.10±0.69** 11.71±1.74* 69.20±4.07*

4 討論

咳嗽作為呼吸道常見癥狀，具有清除呼吸道異物和分泌物的保護(hù)性作用。常用的鎮(zhèn)咳藥理活性研究模型包括氨水引咳法、SO2 引咳法、辣椒素引咳法、豚鼠枸櫞酸引咳法[19，20]。其中，以氨水引咳法最為經(jīng)典，故本試驗(yàn)采取該法測(cè)定烏蘇里瓦韋的鎮(zhèn)咳作用。

痰液是呼吸道受炎癥因子侵入時(shí)，纖毛運(yùn)動(dòng)減慢，粘膜上皮受損，黏蛋白分泌異常增加，積累粘液而引起的痰狀物質(zhì)。祛痰藥可使痰液變稀而易于咳出，主要是通過改善咳嗽清除率和黏液纖毛系統(tǒng)清除率來祛痰[21]。常用的祛痰藥理活性研究模型包括氣管酚紅排泌法、毛細(xì)玻管法[22]。其中，氣管酚紅排泌法是利用酚紅能夠部分從氣管排泌的特點(diǎn)，準(zhǔn)確性好、可操作性強(qiáng)，主要針對(duì)小鼠；毛細(xì)玻管法主要針對(duì)大鼠，故本試驗(yàn)采取該法考察烏蘇里瓦韋的祛痰活性。

IL-6 為活化的T 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，是能使B細(xì)胞前體成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，又名B細(xì)胞刺激因子，在被TNF-和IL-1誘導(dǎo)后，通過激活炎性介質(zhì)來調(diào)節(jié)急性炎癥反應(yīng)及免疫功能等[23]。IL-1是免疫細(xì)胞在免疫應(yīng)答時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能夠刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，在免疫應(yīng)答和組織修復(fù)中起重要作用，有IL-1和IL-12 種形式，其中，IL-1又名前炎性反應(yīng)細(xì)胞因子、淋巴細(xì)胞活化因子，能通過多種生物學(xué)功能參與免疫應(yīng)激和信號(hào)傳導(dǎo)，在受到致炎因素刺激時(shí)較短時(shí)間內(nèi)可促使炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，幾小時(shí)內(nèi)便可達(dá)到峰值[24]。TNF-是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，在炎性細(xì)胞的增殖、分化中起到重要的中介作用。有研究證實(shí)，血清中TNF-的含量與急性肺損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[25]。本試驗(yàn)中選用IL-6、IL-1和TNF-作為指標(biāo)成分以判斷烏蘇里瓦韋是否具有抗炎作用，進(jìn)而判斷其是否通過抗炎而發(fā)揮鎮(zhèn)咳和祛痰的藥理作用?？寡姿幚砘钚匝芯恐?，LPS 的常用給藥方式有腹腔注射法、氣管內(nèi)滴入法、氣管內(nèi)注射法和氣管內(nèi)霧化法等，其中，氣管內(nèi)霧化法缺少相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材，氣管內(nèi)注射法相比腹腔注射靶向性更強(qiáng)，相比于滴入操作更簡(jiǎn)便[16]，故本試驗(yàn)采取該法考察烏蘇里瓦韋的祛痰活性。

藥用植物烏蘇里瓦韋具有清熱解毒、利尿消腫、止咳止血等功效，具有較好的抗小鼠耳廓腫脹的作用，但未見其鎮(zhèn)咳和祛痰作用的研究。為開發(fā)防治呼吸系統(tǒng)疾病的中草藥提供理論數(shù)據(jù)，本試驗(yàn)以烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物（總黃酮15.8%、總酚酸8.7%）為樣品，研究了其對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳和祛痰作用，并初步探討了其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烏蘇里瓦韋提取物高、中劑量組能夠延長氨水誘導(dǎo)的小鼠咳嗽潛伏期，同時(shí)顯著減少單位時(shí)間內(nèi)咳嗽次數(shù)，并能夠顯著促進(jìn)小鼠氣管酚紅的排泌量，表明其具有較好的鎮(zhèn)咳和祛痰作用。在機(jī)制的初步探討中發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)咳和祛痰作用最為顯著的烏蘇里瓦韋高劑量組能夠明顯降低LPS誘導(dǎo)的ICR小鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-的含量，提示鎮(zhèn)咳和祛痰作用可能與抑制血清中的炎癥因子和TNF-有關(guān)。