睪丸的細(xì)針穿刺法檢測梅花鹿和馬鹿雜交雄性后代是否可育的研究

陳敏，楊鎰峰，曹俊國，陳秀敏，許保增，魏海軍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

活體組織檢查（Biopsy）簡稱“活檢”，是醫(yī)療上診斷病理學(xué)的重要方法。常用于睪丸的活檢方式主要有開放式活檢、顯微活檢、細(xì)針抽吸活檢和空芯針活檢。開放式活檢能夠觀察到睪丸白膜狀態(tài)，通過獲取的組織可以觀察曲細(xì)精管直徑、基質(zhì)厚度等特征，但是創(chuàng)傷大，術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病幾率高[1]。而細(xì)針抽吸活檢的優(yōu)點(diǎn)是創(chuàng)傷小，少見手術(shù)并發(fā)癥，短期內(nèi)可以重復(fù)進(jìn)行，其操作簡單、快速、成本低，獲得的材料可以用于量化精子的發(fā)生。在用穿刺法對(duì)駱駝睪丸的評(píng)估中，其結(jié)果與睪丸超聲一致[2]。睪丸的細(xì)針穿刺在檢測鹿的雄性不育，尤其是區(qū)別梗阻與非梗阻無精癥方面是一種方便快捷而準(zhǔn)確、安全的方法。Pintus 等[3-4]在馬鹿上使用此項(xiàng)技術(shù)研究支持細(xì)胞和精子季節(jié)變化及唯支持細(xì)胞綜合癥。本試驗(yàn)采用細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查和睪丸體積測量相結(jié)合的方法對(duì)梅花鹿和馬鹿雜交F1 代是否可育進(jìn)行初步調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

用于檢測的花馬雜交雄性后代來自A、B、C、D、E 5 個(gè)鹿場（表1）。其中，花馬雜交雄性后代14 只，馬花雜交雄性后代16 只，均為4 歲以上成年鹿。

表1 實(shí)驗(yàn)公鹿信息Table 1 Experimental male deer information

1.2 試劑、器械和儀器

10 mL 注射器/22G 針頭（長春民建醫(yī)療器械有限公司）；多聚賴氨酸處理的防脫載玻片（南通海倫生物醫(yī)學(xué)器材制造有限公司）；磷酸緩沖溶液（Gibco公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；吉姆薩染料（上海歌凡生物公司）；鹿眠寶3 號(hào)（90.0%～110.0%尼可剎米）和鹿醒寶（95.0%～105.0%賽拉嗪）（青島漢河動(dòng)植物藥業(yè)有限公司）；光學(xué)顯微鏡（Olympus Corporation 公司）；游標(biāo)卡尺、恒溫水浴鍋（國華電器公司）

1.3 細(xì)針穿刺法

取樣前由技術(shù)員對(duì)被試雄鹿注射適量鹿眠寶3 號(hào)進(jìn)行麻醉，待完全麻醉自行倒臥之后用保定裝置將公鹿保定。用手通過牽拉陰囊后方皮膚的方式將睪丸固定，防止睪丸位置移動(dòng)。依次使用碘伏和75%的乙醇對(duì)待穿刺部位進(jìn)行消毒，避開附睪和血管選擇合適的穿刺位點(diǎn)，在睪丸不同部位進(jìn)行穿刺采樣（如采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)樣品內(nèi)混有血液則需要重新選擇其他部位進(jìn)行穿刺采樣），每次采樣的量以滿足5 張涂片為宜。穿刺時(shí)輕柔進(jìn)針，進(jìn)入睪丸5～8mm，在不退出針頭的情況下利用負(fù)壓將組織吸出，緩慢拔出細(xì)針，用蓋玻片將獲取的細(xì)胞和組織均勻地涂抹在載玻片上，室溫靜置干燥，供細(xì)胞學(xué)檢查。

1.4 睪丸細(xì)胞觀察

1.4.1 染色 將0.1 g 吉姆薩染料與6.6 mL 甘油混合后在60 ℃中水浴2 h，每隔20 min 搖晃1 次，水浴結(jié)束后加入6.6 mL 甲醇；使用前再加入120 mL 磷酸緩沖溶液（pH 6.8）。

將待染色的載玻片放置在染色架上，浸入染色液中，室溫放置15 min。取出載玻片，將其傾斜，使自來水從載玻片的反面成股流下，以達(dá)到輕柔沖洗的目的。

1.4.2 顯微鏡觀察 在低倍鏡下找到聚堆、互相不重疊的細(xì)胞，再在40 倍鏡下根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)及染色情況確定細(xì)胞的種類，每張載玻片選擇5～8 個(gè)視野進(jìn)行拍照保存。

1.5 睪丸體積測量

用游標(biāo)卡尺分別測量鹿睪丸的長軸和短軸，并用公式V=4/3ab2（a=長半軸；b=短半軸）計(jì)算睪丸體積[5]。

2 結(jié)果

通過細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查，共發(fā)現(xiàn)了3 頭無法正常進(jìn)行精子發(fā)生的雄鹿。正常雜交雄鹿細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果見圖1。

圖1 正常雜交F1代雄鹿的細(xì)胞學(xué)檢查Figure 1 Cytological examination of the normal hybrid F1 buck

086號(hào)雄性雜交鹿是由雌性馬鹿與雄性梅花鹿交配得到的后代，來自B 鹿場。觀察結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)有成熟形態(tài)的精子。從圖2 中可以看出，086 號(hào)鹿的精子發(fā)生終止于精子形成的第13 階段，此時(shí)精子的細(xì)胞核縮短到之前的20%。根據(jù)鹿場技術(shù)員反映，2013年用該公鹿作為種鹿進(jìn)行配種，母鹿均未受孕；2014年對(duì)086 號(hào)鹿進(jìn)行人工采精，沒有采集到正常精液。上述結(jié)果均證明該雄性雜交鹿是不育的，與細(xì)針穿刺法檢測的結(jié)果是一致的。見圖2。

圖2 086號(hào)雜交鹿的細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果Figure 2 Cytological examination of hybrid sterile buck 086

261號(hào)雄性鹿的母本是南疆馬鹿，父本是梅花鹿，來自E 鹿場。睪丸細(xì)針穿刺取樣后進(jìn)行涂片檢測試驗(yàn)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有成熟形態(tài)的精子。從圖3 中可以分辨出初級(jí)精母細(xì)胞（圓形、核質(zhì)松散）和支持細(xì)胞（輪廓不清晰、染色較淺），沒有出現(xiàn)過更接近精子的細(xì)胞，說明261 號(hào)精子的發(fā)生可能被阻止在較早的階段。

圖3 261號(hào)雜交鹿的細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果Figure 3 Cytological examination of hybrid sterile buck 261

210號(hào)雄性鹿是馬鹿（母本）與梅花鹿（父本）的雜交后代，來自E 鹿場。睪丸細(xì)針穿刺取樣后進(jìn)行涂片檢測試驗(yàn)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有成熟形態(tài)的精子，支持細(xì)胞占了多數(shù)，僅有部分精原細(xì)胞（細(xì)胞體積小、細(xì)胞核大），說明210 號(hào)鹿的精子發(fā)生在一開始就受到了阻礙（圖4）。261號(hào)和210號(hào)鹿出自同一鹿場，兩者都接受過6 次人工采精，均以失敗告終，這與細(xì)胞學(xué)檢測的結(jié)果同時(shí)說明261 號(hào)鹿和210 號(hào)鹿都是不育的。

圖4 210號(hào)雜交鹿的細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果Figure 4 Cytological examination of hybrid buck 210.

4頭正常雜交雄性鹿（鹿號(hào)分別為2276 號(hào)、2272號(hào)、193 號(hào)和196 號(hào)）都來自B 鹿場，標(biāo)本采集時(shí)間分別為7月（2276 號(hào)）、8月（2272 號(hào)）和10月（193 號(hào)和196 號(hào)）。精子細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)，正常的雄鹿在發(fā)情期和乏情期睪丸內(nèi)都是有正常形態(tài)的精子存在的（圖5）。因此，可以采用細(xì)針穿刺法來提前檢測雄鹿是否具有產(chǎn)生正常形態(tài)精子的能力。在生產(chǎn)實(shí)踐中，可以提前采用此方法來預(yù)測雄性鹿的繁殖期能力，從而避免沒有繁殖能力的雄鹿進(jìn)入配種階段，從而能避免由此帶來的不必要的損失。

圖5 花馬雜交雄鹿的細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果Figure 5 Cytological results of normal hybrid buck

通過對(duì)睪丸體積測定分析結(jié)果表明，不育雄鹿與可育雄鹿相比，兩側(cè)睪丸體積沒有明顯差別。086 號(hào)和261 號(hào)鹿的兩側(cè)睪丸均高于平均水平，但210 號(hào)鹿的兩側(cè)睪丸都大幅低于平均。見圖6。

圖6 不育雄性與正常雄鹿睪丸體積的對(duì)照Figure 6 Comparison of testicular volume between sterile males and normal males

通過按壓睪丸表面發(fā)現(xiàn)，210 號(hào)鹿的睪丸硬度很低、彈性較小，而086 號(hào)鹿的睪丸硬度大于正常雄鹿、彈性較小。在現(xiàn)場的觀察中還發(fā)現(xiàn)，這3 頭不育雄鹿在繁殖期與可育雜交雄鹿發(fā)情、交配行為基本一致，具體表現(xiàn)為吼叫，吼叫時(shí)會(huì)伸長頸部并將頭部仰起；泥浴，在泥土中排尿并在其中翻滾，使身體散發(fā)濃烈的氣味；跟蹤，有追逐雌鹿的行為；梳舔，雄鹿有主動(dòng)靠近雌鹿，為其梳舔頭部毛發(fā)的行為；爬跨，雄鹿使用前肢壓在雌鹿背部后肢著地；有性行為反射。因此，雄鹿在繁殖期的發(fā)情交配行為和睪丸體積及狀態(tài)能否作為檢測雄性雜交鹿是否可育的一項(xiàng)指標(biāo)，仍需要進(jìn)一步的研究及驗(yàn)證。

3 討論

對(duì)睪丸活檢的研究和應(yīng)用大多是針對(duì)人類患有非梗阻性無精子癥的男性，采用輔助手段從局部生精灶獲取精子以獲得后代。常見的睪丸活檢方法包括開放性睪丸活檢、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)、活檢槍、活檢鉗和顯微切割睪丸活檢等[6-9]。開放性睪丸活檢是獲取睪丸組織和評(píng)價(jià)精子發(fā)生最準(zhǔn)確的方式，但是由于會(huì)誘發(fā)多種并發(fā)癥而不被廣泛采用[10-11]。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)是采用帶針頭的注射器對(duì)睪丸進(jìn)行經(jīng)皮穿刺，這種方法對(duì)睪丸的損傷很小，能同時(shí)清晰地觀察到各種不同階段的生殖細(xì)胞，同時(shí)不易引起并發(fā)癥[12]。活檢鉗是采用輸精管剝離鉗的經(jīng)皮穿刺，優(yōu)點(diǎn)是創(chuàng)口小、出血少、取樣率高?；顧z槍是利用高速機(jī)械切割原理來獲得樣品，其優(yōu)點(diǎn)與活檢鉗類似，但造成的疼痛較輕[13]。顯微切割是在解剖顯微鏡下操作的一種手術(shù)方法，近些年在人類臨床上的應(yīng)用比較普遍，這種方法能夠避開白膜下血管，術(shù)中出血少，但由于設(shè)備的限制，并不方便采用此方法在養(yǎng)殖現(xiàn)場進(jìn)行檢查[14]。

在實(shí)際生產(chǎn)中，人們會(huì)優(yōu)先選擇鹿茸產(chǎn)量高的公鹿作為種鹿進(jìn)行配種，因此有些產(chǎn)茸性狀突出但沒有生育能力的雜交公鹿會(huì)被誤用做種鹿，這樣就會(huì)給養(yǎng)殖者帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此檢測公鹿是否可育是非常有必要的。細(xì)針穿刺能夠快速獲取雄性睪丸器官中的間質(zhì)細(xì)胞、生精小管等細(xì)胞、組織和體液，且檢測過程簡便易行，能夠方便快速地判斷公鹿是否能夠作為種鹿參加配種，同時(shí)對(duì)被測公鹿的損傷輕微，是進(jìn)行鹿生育能力檢測的有效手段，在生產(chǎn)實(shí)際中可以采用此種方法對(duì)公鹿睪丸的檢查，從而判斷公鹿是否可以作為種鹿參加配種。Gosch[15]通過電刺激采精發(fā)現(xiàn)，黇鹿的精液體積是季節(jié)性變化的，其精子發(fā)生的活躍度在1年中是不同的，每年會(huì)有約3 個(gè)月的時(shí)間精子發(fā)生活動(dòng)是停止的，在5～8月進(jìn)行電刺激采精是不能獲得精子的，然而在家畜中，從精子發(fā)生到成熟共需51～60d。本試驗(yàn)在繁殖期和非繁殖期都對(duì)雜交鹿進(jìn)行了細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查，在非繁殖期的檢查結(jié)果中也能發(fā)現(xiàn)完整精子的存在，這就說明細(xì)針穿刺能夠用于非繁殖期診斷雜交公鹿是否可育。尤其是在非繁殖季節(jié)電刺激采精不能獲得精子的時(shí)候可以考慮采用細(xì)針穿刺的方法進(jìn)行診斷，以獲得更加準(zhǔn)確的判斷。這種檢測方法的應(yīng)用可以杜絕目前市場上把不育的雜交鹿作為種公鹿進(jìn)行交易，避免廣大養(yǎng)殖戶遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

精子發(fā)生過程中各階段的細(xì)胞有不同的形態(tài)，精原細(xì)胞一般為圓形或多角形，有典型的強(qiáng)分裂能力，細(xì)胞體積小但細(xì)胞核大，細(xì)胞核占細(xì)胞的比例很高，細(xì)胞核是圓形或卵圓形，染色質(zhì)較大，占據(jù)了精原細(xì)胞的很大一部分體積；在經(jīng)歷了有絲分裂后，初級(jí)精母細(xì)胞的體積比精原細(xì)胞大，染色質(zhì)松散，呈現(xiàn)顆粒狀，之后初級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂階段則會(huì)出現(xiàn)分裂相；初級(jí)精母細(xì)胞在經(jīng)歷了1 次減數(shù)分裂后變成次級(jí)精母細(xì)胞，其體積變小，呈橢圓形或者圓形，次級(jí)精母細(xì)胞一般存在的時(shí)間很短，因此，在細(xì)胞學(xué)檢查時(shí)，視野中的次級(jí)精母細(xì)胞所占比例很??；精子細(xì)胞的體積隨著形變的進(jìn)行而不斷變小，細(xì)胞變長、核變長；成熟精子的最明顯特點(diǎn)是有長長的尾部[16]。睪丸體積能反應(yīng)支持細(xì)胞的發(fā)育情況，而支持細(xì)胞能夠?yàn)榫?xì)胞提供營養(yǎng)、調(diào)節(jié)生境周期，因此，睪丸的體積可能成為判斷是否可育的標(biāo)準(zhǔn)[3]。對(duì)比這3 頭鹿可以發(fā)現(xiàn)，它們的精子發(fā)生被阻斷的階段不同，推測引起這些雄鹿不育的原因可能有多個(gè)。