西洋參果多糖的純化及DPPH自由基清除活性研究

李珊珊，祁玉麗,2，曲迪，張磊，孫印石,2※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118）

西洋參（Panax quinquefolius）屬五加科人參屬植物，原產(chǎn)于美國和加拿大，現(xiàn)我國也有栽培。西洋參味甘、微苦，性寒，能補(bǔ)氣、養(yǎng)陰、清火。關(guān)于西洋參的研究較多，而其果實(shí)的研究較少。西洋參果中含有皂苷、糖類等成分[1]。多糖在西洋參果中含量豐富，但目前為止相關(guān)報道非常少。西洋參果多糖能夠顯著降低ob/ob小鼠的空腹血糖水平，增加小鼠對葡萄糖的耐受性，具有明顯的降血糖活性[2]。本試驗(yàn)對西洋參果水溶性總多糖進(jìn)行系統(tǒng)地分級和純化，并對其單糖組成、總糖含量、糖醛酸含量、分子量分布及1，1-二苯基-2-二硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性進(jìn)行分析和檢測，為西洋參果的進(jìn)一步加工利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西洋參果采收于吉林省撫松縣；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma-Aldrich 公司）；層析柱和凝膠（GE 公司）；DPPH（Cat#CD4891-500MG，Coolaber公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16A 高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FD-1A-50 低溫冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司）；QD8J（BL）單煎機(jī)（青島達(dá)爾電子機(jī)械銷售有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

高效液相色譜儀及色譜柱、SPD-M20A 紫外檢測器、LC-16溶劑輸送泵、CTO-16柱溫箱（日本島津儀器有限公司）；ODS Hypersil 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5m）（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 西洋參果總多糖的提取 采收新鮮西洋參果，手搓去籽，果肉加入蒸餾水8 L/ kg，單煎機(jī)100 ℃提取4 h，紗布（100 目）過濾，留取濾液，沉淀重復(fù)提取2次。合并3 次提取所得濾液，單煎機(jī)微沸狀態(tài)濃縮至1.5 L，離心（4 500 r/min，10 min），棄去沉淀，上清于60 ℃水浴濃縮至終體積為1 L，冷卻至室溫。加入4 L 無水乙醇，靜置5 h，離心（4 500 r/min，10 min），收集沉淀。向沉淀中加入800 mL 蒸餾水，充分溶解，重復(fù)上述醇沉步驟。沉淀用蒸餾水復(fù)溶后冷凍干燥，得西洋參果總多糖（WQBP）。

1.3.2 西洋參果多糖的分離純化 取5 g WQBP溶于80 mL 蒸餾水中，離心（4 500 r/min，10 min），上樣于DEAE-Sepharose Fastflow 層析柱，依次用2 L 蒸餾水和0.5 mol/L NaCl 溶液洗脫，流速10 mL/min，每燒杯收集50 mL 洗脫液。分別收集不同的洗脫峰，水洗脫級分濃縮后冷凍干燥，得到中性糖級分WQBP-N；鹽洗脫級分透析除鹽后冷凍干燥，得到酸性糖級分WQBP-A。

1.3.3 理化性質(zhì)測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[3]；間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸的含量[4]。單糖組成分析[5-6]：稱取2 mg 多糖樣品，依次用1 mol/L 鹽酸-甲醇溶液和2 mol/L 三氟乙酸溶液水解。除去有機(jī)試劑后，PMP 衍生化，HPLC 檢測。HPLC 系統(tǒng)：Hypertsil ODS色譜柱，柱溫35℃，流動相82.0% PBS（0.1 mol/L，pH 7.0）和18.0%乙腈（v/v），等梯度洗脫，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20L，檢測波長245 nm。

1.3.4 多糖級分的分子篩層析分析 取5 mg 多糖樣品溶于1mL 蒸餾水中，離心（10000r/min，5min），上清液上樣于Sepharose CL-6B 凝膠層析分析柱[7]，0.15 mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.15 mL/min，收集器20 mL/管自動收集洗脫液。測定洗脫液的總糖和糖醛酸含量分布，繪制洗脫曲線。

1.3.5 多糖級分的DPPH 清除率檢測 將樣品配制成0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL 濃度梯度的水溶液。取0.5 mL 樣品溶液，加入0.5 mL 5%DPPH 乙醇溶液，混勻后避光反應(yīng)1 h，517 nm 測吸光值[8]。DPPH 清除率=〔1 （A 樣品 A空白）/A 對照〕×100%，A 樣品：0.5 mL 樣品溶液+0.5 mL DPPH；A 空白：0.5 mL 樣品溶液+0.5 mL 無水乙醇；A 對照：0.5 mL DPPH+0.5 mL 蒸餾水。

2 結(jié)果與分析

2.1 西洋參果多糖的分級純化及單糖組成分析

西洋參果多糖得率為0.7%。通過HPLC 分析單糖組成（表1），WQBP主要由鼠李糖（Rhamnose，Rha，5.9%）、半乳糖醛酸（Galacturonic acid，GalA，8.6%）、半乳糖（Galactose，Gal，51.8%）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara，14.0%）、葡萄糖（Glucose，Glc，16.4%）和少量葡萄糖醛酸（Glucuronic acid，GlcA）、甘露糖（Mannose，Man）組成。WQBP 在Sepharose CL-6B 分析柱上呈現(xiàn)不均一的峰（圖1），分子量分布較廣，不適合用該層析柱進(jìn)行進(jìn)一步的分級純化。

表1 西洋參果多糖各級分的得率、總糖含量、糖醛酸含量及單糖組成Table 1 Yield,total carbohydrate contents,uronic acid contents and monosaccharide composition of P.quinquefolius berry polysaccharide fractions

圖1 WQBP 在Sepharose CL-6B 分析柱上的洗脫曲線Fig.1 Elution profiles of WQBP on Sepharose CL-6B

2.1.1 離子交換層析純化 將WQBP 上樣于DEAESepharose Fastflow 制備柱，依次用蒸餾水、0.5 mol/L NaCl 洗脫，得到1 個中性糖級分WQBP-N 和1 個酸性糖級分WQBP-A（圖2），得率及單糖組成見表1。

圖2 WQBP 經(jīng)DEAE-Sepharose Fastflow 層析柱分級純化洗脫曲線Fig.2 Elution profiles of WQBP on DEAE-Sepharose Fastflow column

2.1.2 西洋參果多糖級分的分子篩層析和單糖組成分析 WQBP-N是西洋參果多糖的中性糖級分，在Sepharose CL-6B分析柱上呈現(xiàn)2 個明顯的洗脫峰（圖3）。WQBP-N 主要由Gal、Ara、Glc 和Man 組成（表1），比例為63.9∶19.3∶15.2∶1.5，其中，Gal含量最高，可能含有半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖等結(jié)構(gòu)單元。

圖3 WQBP-N 在Sepharose CL-6B 柱層析上的洗脫曲線Fig.3 Elution profiles of WQBP-N on Sepharose CL-6B

WQBP-A 在Sepharose CL-6B 層析柱上呈現(xiàn)2 個明顯的洗脫峰（圖4）。WQBP-A 主要由Rha（13.1%）、GalA（13.2%）、Gal（46.4%）、Ara（19.0%）組成，含有少量的Man、Glc 和GlcA（表1）。Rha 與GalA 的比例為0.99∶1，符合文獻(xiàn)[9]中對I 型聚鼠李半乳糖醛酸果膠（Type I rhamnogalacturonan，RG-I）的定義。根據(jù)Rha與GalA 的含量與比例可以推測，WQBP-A 中含有RG-I結(jié)構(gòu)域，Gal 和Ara 含量較高，可能含有阿拉伯半乳聚糖結(jié)構(gòu)單元。

圖4 WQBP-A 在Sepharose CL-6B 柱層析上的洗脫曲線Fig.4 Elution profiles of WQBP-A on Sepharose CL-6B

2.2 西洋參果多糖各級分對DPPH自由基的清除活性

西洋參果總多糖WQBP 具有顯著的DPPH 自由基清除活性。在0.1～1 mg/mL 范圍內(nèi)清除率隨濃度的升高而逐漸加強(qiáng)，當(dāng)WQBP 濃度為1.0 mg/mL 時，清除率可達(dá)82.1%。WQBP-N 對DPPH 自由基的清除活性最弱。WQBP-A 活性弱于WQBP，略高于WQBP-N，并且也有一定的濃度依賴性。見圖5。

圖5 西洋參果多糖各級分的DPPH 清除率Fig.5 Scavenge ability of DPPH radical of P.quinquefolius berry polysaccharide fractions

3 討論

多糖是自然界最為豐富的物質(zhì)之一，具有多種藥理活性[10-12]。本研究對西洋參果多糖進(jìn)行了提取、分級和純化，分析各級分的單糖組成、總糖含量、糖醛酸含量等發(fā)現(xiàn)，西洋參果多糖中含有豐富的GalA、Gal、Ara 和Rha。WQBP-N 含有半乳聚糖結(jié)構(gòu)，但具體的糖苷鍵連接方式和比例還不清楚。WQBP-A 為富含Rha 和GalA 的酸性果膠組分，屬于雜多糖，分子量和電荷不均一。WQBP 具有顯著的DPPH 自由基清除活性和潛在的抗氧化能力，且活性優(yōu)于WQBP-N 和WQBP-A。對這些多糖級分進(jìn)行進(jìn)一步的純化，獲得均一多糖，進(jìn)而分析其精細(xì)結(jié)構(gòu)，如糖苷鍵的連接方式、比例、是否含有特殊基團(tuán)等，對研究多糖的結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系具有重要意義，也是下一步研究的重點(diǎn)。