解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜互作特性研究

張 瑩 秦宇軒 尚慶茂 張一凡 李昌輝 李平蘭

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所， 北京 100081)

0 引言

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根際的一類促進(jìn)植物生長及礦質(zhì)營養(yǎng)吸收和利用，抑制有害微生物的生防益生菌[1]。而PGPR在實(shí)際應(yīng)用過程中，會直接受到附生植物根系分泌物的影響。植物的根系分泌物是調(diào)控植物-根際微生物的關(guān)鍵因素，是研究PGPR與宿主植物互作影響與機(jī)制的關(guān)鍵[2]。

根系分泌物作為植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體物質(zhì)，主要是指植物在生長過程中，通過根分泌的方式向根周圍釋放一些無機(jī)離子和有機(jī)化合物，這些物質(zhì)統(tǒng)稱為根系分泌物[3]。研究發(fā)現(xiàn)，根系分泌物中含有的諸如糖、氨基酸和有機(jī)酸等低分子量物質(zhì)，對植物-微生物種間互作發(fā)揮著重要作用[4]。而對于PGPR來說，這些成分不但可以作為其良好的碳源，還常作為信號分子起到趨化作用，促進(jìn)其在根際定殖[5]。DE等[6]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌WCS365受到番茄根系分泌物中的蘋果酸和檸檬酸的趨化作用，并且根系分泌物會影響菌株鞭毛的運(yùn)動性；PETERS等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氮條件下，豆科植物的根系通過分泌類黃酮來誘導(dǎo)啟動根瘤菌的結(jié)瘤基因nodD的表達(dá)，最終導(dǎo)致根瘤菌成功侵染根系并形成根瘤；某些PGPR能夠利用植物根系分泌物的成分作為生物合成的前體，研究表明，燕麥會在根尖部分泌色氨酸用于PGPR轉(zhuǎn)化為生長素(吲哚乙酸)，進(jìn)而促進(jìn)自身的生長[8]。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)L-S60是一株分離自土壤，具有優(yōu)良促生抗病特性的植物根際促生菌[9]，應(yīng)用于植物生防方面具有很大的潛力。為了更好地理解植物根際促生菌與植物互作這一復(fù)雜過程，本研究分析淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜(CucumissativusL.)的互作過程。由于對根際分泌物的趨化和運(yùn)動性是微生物定殖根際的前提條件，首先研究黃瓜根系分泌物的主要成分有機(jī)酸及氨基酸對菌株的的趨化作用及菌株的利用情況。在建立菌株與黃瓜幼苗互作模型后，通過計(jì)數(shù)的方式研究菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量隨時(shí)間變化的關(guān)系，并且通過熒光定量PCR的方式分析與黃瓜根系互作后菌株和根際定殖、群集運(yùn)動、生物被膜形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

解淀粉芽孢桿菌L-S60，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物研究室提供。

黃瓜品種為“中農(nóng)6號”，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 菌株受黃瓜根系分泌物成分影響的確定

1.2.1有機(jī)酸成分對菌株的趨化試驗(yàn)

將ADLER[10]的方法略作修改，進(jìn)行菌株對有機(jī)酸趨化作用的定量測定，將不同濃度(50、100、200 μmol/L)的有機(jī)酸趨化液(將檸檬酸、草酸、琥珀酸及蘋果酸4種有機(jī)酸分別溶于PBS緩沖液，用0.22 μm的濾膜過濾除菌)取5 mL加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將活菌數(shù)約為108CFU/mL的菌液離心后重懸在等體積的無菌PBS緩沖液中，將吸有菌懸液的內(nèi)徑1 mm、長度3 cm的無菌毛細(xì)管分別放入上述6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃靜置1 h，以不加有機(jī)酸的PBS緩沖液為空白對照，將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的有機(jī)酸趨化液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.2.2菌株對有機(jī)酸的利用試驗(yàn)

將活菌數(shù)約為108CFU/mL的菌液以0.5%的接種量接種于pH值調(diào)節(jié)為5.5、濃度200 μmol/L的有機(jī)酸(檸檬酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸)Hoagland營養(yǎng)液[11]中，以不加有機(jī)酸的Hoagland營養(yǎng)液(pH值5.5)為空白對照，37℃、200 r/min培養(yǎng)12、36 h，采用平板計(jì)數(shù)的方式計(jì)算培養(yǎng)液中的菌數(shù)。

1.2.3氨基酸成分對菌株的趨化試驗(yàn)

不同質(zhì)量濃度(5、10、20 μg/mL)的氨基酸趨化液(將谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸及色氨酸4種氨基酸分別溶于PBS緩沖液，用0.22 μm的濾膜過濾除菌)分別取5 mL加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，其余步驟同1.2.1節(jié)。

1.2.4菌株對氨基酸的利用試驗(yàn)

將活菌數(shù)約為108CFU/mL的菌液以0.5%的接種量接種于pH值調(diào)節(jié)為5.5、質(zhì)量濃度20 μg/mL的氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸)Hoagland營養(yǎng)液中，其余步驟同1.2.2節(jié)。

1.3 菌株與黃瓜幼苗互作模型的建立

參照GRAHAM等[12]的方法且適當(dāng)修改，具體方法如下：

(1)種子催芽：取黃瓜種子若干，用清水浸泡2 h，75%乙醇浸泡1 min，5%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無菌水沖洗至無刺鼻氣味。在滅菌的培養(yǎng)皿(內(nèi)墊有無菌水潤濕的濾紙)中加入適量的無菌水，每皿放置約40粒消毒種子，室溫(20℃)放置1 h后轉(zhuǎn)至暗處，28℃培養(yǎng)48 h。

(2)將催芽后的種子播種于裝有滅菌無土栽培基質(zhì)(蛭石與珍珠巖體積比為1∶1)的穴盤中，置于28℃光照培養(yǎng)箱(16 h光照，8 h黑暗)，每隔24 h用2倍稀釋的Hoagland營養(yǎng)液灌根，直至長出第1片真葉(播種后約14 d)。

(3)將穴盤取出，在每孔中加入過量的無菌水，小心拔出黃瓜幼苗，盡量不破壞幼苗的根系，用無菌水洗凈根表面的基質(zhì)，每20棵黃瓜苗根系浸入添加50 μg/mL利福平的200 mL滅菌水中，2 h后用無菌水洗凈根系。

(4)將活菌數(shù)約為108CFU/mL的菌液離心后重懸在等體積的Hoagland營養(yǎng)液中，吸取5 mL加入含有45 mL Hoagland營養(yǎng)液的50 mL錐形瓶中，每瓶加入5棵處理好的黃瓜苗，用無菌脫脂棉封口及固定黃瓜苗。將錐形瓶用錫紙包好(植物根系需避光生長)，在28℃光照培養(yǎng)箱(16 h光照，8 h黑暗)中培養(yǎng)。

1.4 菌株在水培黃瓜幼苗根系表面定殖量測定

按不同培養(yǎng)時(shí)間(6、12、18、24、36、48 h)將黃瓜幼苗根系移出，用無菌水沖洗掉根系表面的菌株后，切取1 g根系置于9 mL無菌生理鹽水中，渦旋1 min，平板計(jì)數(shù)。

1.5 菌株定殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

1.5.1細(xì)菌總核糖核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄

按不同培養(yǎng)時(shí)間(0.25、0.5、1、2、4、6、8 h)將植物根系移除后，將菌液低溫離心，棄上清液后加入液氮研磨，采用TRIzol法提取細(xì)菌總核糖核酸(RNA)[13]。將提取后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：RNA 5 μg，Random Primer 1 μL，5×RT Reaction Mix 4 μL，TUREscript H-Rtase 0.8 μL，加DEPC水至總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：25℃，10 min；42℃，30 min；65℃，15 min。

1.5.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)菌株與根際定殖、群集運(yùn)動、生物被膜形成相關(guān)功能的共17個基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)，采用20 μL反應(yīng)體系對基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，其中SYBR(2×)qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板為1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95℃，30 s；95℃，5 s；62℃，30 s；40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析參考MORISSET等[14]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株受黃瓜根系分泌物成分的影響

2.1.1有機(jī)酸成分對菌株的趨化試驗(yàn)

由圖1可知，檸檬酸、草酸、琥珀酸及蘋果酸4種有機(jī)酸對解淀粉芽孢桿菌L-S60均具有正趨化作用，整體來看，有機(jī)酸對于L-S60的趨化作用都較為微弱，且趨化作用對有機(jī)酸的濃度有較強(qiáng)的依賴性。其中，蘋果酸對L-S60的趨化作用最強(qiáng)，以濃度為200 μmol/L時(shí)為最佳；而草酸和檸檬酸對菌株的趨化作用相對較弱。

2.1.2菌株對有機(jī)酸的利用試驗(yàn)

由圖2可知，解淀粉芽孢桿菌L-S60能夠利用蘋果酸作為唯一的碳源進(jìn)行生長，在培養(yǎng)36 h時(shí)，活菌數(shù)依然保持上升趨勢。而L-S60利用其他3種有機(jī)酸的效果并不明顯，雖然活菌數(shù)都高于空白對照，但仍為下降趨勢。

表1 與根際定殖、群集運(yùn)動、生物被膜形成相關(guān)基因引物序列Tab.1 Primers sequence of genes involved in root colonization, swarming motility and biofilm formation

圖1 有機(jī)酸對L-S60的趨化作用Fig.1 Chemotaxis toward organic acid from L-S60

圖2 L-S60對有機(jī)酸的利用Fig.2 Utilization of organic acids by L-S60

2.1.3氨基酸成分對菌株的趨化試驗(yàn)

圖3 氨基酸對L-S60的趨化作用Fig.3 Chemotaxis toward amino acid from L-S60

由圖3可知，谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和色氨酸4種氨基酸對解淀粉芽孢桿菌L-S60均具有正趨化作用，整體來看，氨基酸對于L-S60的趨化作用都較為微弱，且趨化作用對氨基酸的濃度有較強(qiáng)的依賴性。其中，谷氨酸對L-S60的趨化作用最強(qiáng)，而其他3種氨基酸的趨化作用相對較弱。

2.1.4菌株對氨基酸的利用試驗(yàn)

由圖4可知，解淀粉芽孢桿菌L-S60對于4種氨基酸的利用效果并不明顯，雖然活菌數(shù)都高于空白對照，但仍為下降趨勢。其中，L-S60對谷氨酸的利用情況最優(yōu)，在培養(yǎng)12 h及36 h時(shí)，添加谷氨酸的培養(yǎng)液中活菌數(shù)顯著大于空白對照及其他種類的氨基酸。

圖4 L-S60對氨基酸的利用Fig.4 Utilization of amino acid by L-S60

2.2 菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量

由圖5可知，L-S60具有在黃瓜幼苗根系表面定殖的能力，且根據(jù)定殖菌數(shù)隨時(shí)間變化的趨勢，在菌株與黃瓜幼苗根際共培養(yǎng)初期，定殖量隨時(shí)間的增長而變大，而在共培養(yǎng)18 h時(shí)，菌株定殖量達(dá)到最大，L-S60的定殖量為1.02×105CFU/g。而共培養(yǎng)18 h后，菌株的定殖量隨時(shí)間的增長而逐漸變小。

圖5 菌株在黃瓜根系表面的定殖量Fig.5 Viable count of L-S60 colonizing cucumber root

2.3 菌株定殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

2.3.1表面黏附相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后，sacB、ycdH及yfiQ3個基因的轉(zhuǎn)錄水平差異見圖6。整體來看，3個與表面黏附相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)，尤其是在互作4 h左右，表達(dá)顯著上調(diào)，因此認(rèn)為菌株在黃瓜幼苗根系有黏附現(xiàn)象的發(fā)生。

圖6 L-S60在不同處理時(shí)間sacB、ycdH及yfiQ基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.6 Difference of sacB, ycdH and yfiQ gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.2表面活性素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后的sfp、yczE、srfAA及comP4個基因的轉(zhuǎn)錄水平差異見圖7。整體來看，除yczE在處理6 h后表達(dá)下調(diào)外，其他基因在處理不同時(shí)間時(shí)整體都表達(dá)上調(diào)，尤其是在互作0.25～0.5 h左右，4個基因表達(dá)顯著上調(diào)，因此認(rèn)為菌株在與黃瓜幼苗根系接觸的過程中會分泌表面活性素。

圖7 L-S60在不同處理時(shí)間sfp、yczE、srfAA及comP基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.7 Difference of sfp, yczE, srfAA and comP gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.3群集運(yùn)動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后的efp、swrB及swrA3個基因的轉(zhuǎn)錄水平差異見圖8。整體來看，3個基因隨著處理時(shí)間的增加表達(dá)水平由上調(diào)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橄抡{(diào)，因此認(rèn)為菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期群集運(yùn)動能力較強(qiáng)，而后期菌株逐漸黏附在植物根系，形成了生物被膜。

圖8 L-S60在不同處理時(shí)間efp、swrB及swrA基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.8 Difference of efp, swrB and swrA gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.4生物被膜合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后的spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA7個基因的轉(zhuǎn)錄水平差異見圖9。整體來看，spo0A、sigH及sinR為生物被膜形成過程中的全局調(diào)控因子，spo0A、sigH表達(dá)出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，而sinR表達(dá)出現(xiàn)逐漸下調(diào)的趨勢；在處理時(shí)間8 h左右，epsA的表達(dá)水平上調(diào)并不明顯，而yqxM-sipW-tasA操縱子表達(dá)均上調(diào)，因此認(rèn)為菌株與黃瓜幼苗根系互作過程中能夠形成生物被膜。

圖9 L-S60在不同處理時(shí)間spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.9 Difference of spo0A, sigH, sinR, epsA, yqxM, sipW and tasA gene translational levels of L-S60 at different times

3 討論

3.1 菌株受黃瓜根系分泌物成分的影響

一般來說，根系分泌物被認(rèn)為是影響根際微生物行為和分布的重要因素，由于它們中不同的組分會在根系的不同部位呈現(xiàn)不同的濃度分布，進(jìn)而導(dǎo)致對不同組分有趨化性及偏好性的微生物會呈現(xiàn)出不同的趨化性與定殖行為[15]。RUDRAPPA等[16]發(fā)現(xiàn)擬南芥受病原菌侵染后分泌的蘋果酸可以誘導(dǎo)根際促生菌(枯草芽孢桿菌)定殖；LING等[17]研究發(fā)現(xiàn)蘋果酸和檸檬酸可以促進(jìn)多粘類芽孢桿菌SQR-21在西瓜根際的定殖。HEINRICH等[18]研究了小麥根分泌物對其根際細(xì)菌Azospirilliumlipoferum的趨化作用，認(rèn)為根系分泌物中的氨基酸組分是一種正趨化物質(zhì)；樂毅全等[19]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌No.5對鳳眼蓮根系分泌物中的亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸具有正趨化性。

KAMILOVA等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜根系分泌物中含量最多的4種有機(jī)酸為檸檬酸、草酸、琥珀酸和蘋果酸，因此本試驗(yàn)研究這4種主要有機(jī)酸對菌株的趨化作用及菌株的利用情況。結(jié)果顯示，這4種有機(jī)酸菌對L-S60均具有正趨化作用，且蘋果酸的趨化作用最強(qiáng)。而菌株對除蘋果酸外其他3種有機(jī)酸的利用效果并不明顯，這可能是由于培養(yǎng)液中有機(jī)酸濃度較低，營養(yǎng)成分不足以讓菌株生長，只能減緩其死亡的速度。

KIMANI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜根系分泌物中含量最多的3種氨基酸為谷氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸。而色氨酸是植物生長素吲哚乙酸(IAA)的前體，對于植物的生長發(fā)育起到重要的作用，因此本試驗(yàn)研究這4種氨基酸對菌株的趨化作用。結(jié)果顯示，4種氨基酸對L-S60均具有正趨化作用，且谷氨酸的趨化作用最強(qiáng)。而菌株對于4種氨基酸的利用效果均并不明顯，雖然活菌數(shù)都高于空白對照，但仍為下降趨勢，這可能是由于培養(yǎng)液中氨基酸濃度較低，營養(yǎng)成分不足以讓菌株生長，只能減緩其死亡的速度。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，解淀粉芽孢桿菌L-S60對黃瓜根系分泌的4種有機(jī)酸及氨基酸具有正趨化作用，并且能夠分別利用其中部分有機(jī)酸和氨基酸，這為菌株能夠在黃瓜幼苗根系定殖提供了有力的理論依據(jù)。此外，根系分泌物具體成分在植物-微生物互作方面的詳細(xì)機(jī)制目前尚未明了，有待進(jìn)一步研究。

3.2 菌株在黃瓜幼苗根系定殖情況

本試驗(yàn)采用水培黃瓜幼苗的方式建立了解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜根系互作的模型，首先通過計(jì)數(shù)的方式考察了菌株在黃瓜幼苗根系的定殖情況。雖然在共培養(yǎng)18 h時(shí)達(dá)到了最大定殖量，但隨著時(shí)間的延長，菌株的定殖量降低較大。這可能是由于在模型建立的初始，菌株能夠利用黃瓜根系分泌出的營養(yǎng)物質(zhì)生存，但由于營養(yǎng)物質(zhì)有限，水培營養(yǎng)液中又沒有菌株可利用的能源，導(dǎo)致菌株由于環(huán)境惡劣的原因轉(zhuǎn)變成芽孢休眠狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致根際定殖量的下降。而劉健等[22]也發(fā)現(xiàn)了類似的情況，巨大芽孢桿菌在小麥根際定殖量也會隨著時(shí)間的延長而降低。

本試驗(yàn)通過熒光定量PCR的方式研究了與黃瓜互作菌株定殖相關(guān)17個基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，為了方便討論，將這17個基因分為4類：①sacB、ycdH及yfiQ3個基因均與細(xì)菌在根系的表面黏附過程相關(guān)，sacB表達(dá)果聚糖蔗糖酶(胞外)，產(chǎn)物果聚糖與細(xì)菌的根系粘附定殖相關(guān)[23]；ycdH表達(dá)高親和性Zn2+ABC運(yùn)輸脂蛋白，與細(xì)菌在根系的表面粘附過程相關(guān)[24]；yfiQ表達(dá)細(xì)菌的表面粘附蛋白[24]。②sfp、yczE、srfAA及comP4個基因均與表面活性素合成過程相關(guān)，sfp表達(dá)脂肽和聚酮化合物(主要抗菌物質(zhì))合成必須的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶[25-26]；yczE表達(dá)影響脂肽和聚酮化合物合成的跨膜蛋白[25-26]；srfABCD表達(dá)Surfactin(表面活性素)合成酶[25]，其中srfAA為srfABCD基因簇中的關(guān)鍵基因；comP表達(dá)ComX傳感器激酶，調(diào)控Surfactin的合成[26]。③efp、swrB及swrA3個基因均與表面活性素合成過程相關(guān)，efp表達(dá)延伸因子P(Elongation factor P)類似蛋白，為細(xì)菌群集運(yùn)動所必需的蛋白[27]；swrA和swrB表達(dá)群集運(yùn)動所必需的蛋白(Swarming protein)[27]。④spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA7個基因均與生物被膜的合成過程相關(guān)，spo0A表達(dá)產(chǎn)孢的全局調(diào)控因子，在生物被膜形成的初始階段起著重要的作用[28]；sigH表達(dá)RNA聚合酶相關(guān)的調(diào)控因子σH因子(Sigma factor H)，在芽孢生成階段調(diào)控spo0A啟動轉(zhuǎn)錄，但不影響生物被膜的起始，對生物被膜中輻射狀結(jié)構(gòu)的生長發(fā)揮了重要的作用[28-29]；sinR表達(dá)生物被膜形成的全局調(diào)控因子，負(fù)調(diào)控生物被膜的形成[30]；epsA-O表達(dá)胞外多糖生物合成操縱子，為合成生物被膜所必需[31]，其中epsA為epsA-O基因簇中的關(guān)鍵基因；yqxM-sipW-tasA操縱子表達(dá)合成生物被膜基質(zhì)的主要蛋白，yqxM能夠合成脂蛋白，sipW表達(dá)Ⅰ型信號肽酶，tasA表達(dá)芽孢外壁形成的相關(guān)蛋白[32]。其中，磷酸化的Spo0A會促進(jìn)下游sinI基因的表達(dá)，sinI為sinR的對抗物，sinI會解除sinR對epsA-O和yqxM-sipW-tasA操縱子的抑制作用，進(jìn)而正向調(diào)控生物被膜的形成。此外，表面活性素作為一種自我誘導(dǎo)劑也能夠促進(jìn)yqxM基因的表達(dá)，促進(jìn)生物被膜的形成。

將L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后，4類與菌株定殖相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平具有較為顯著的差異變化：①sacB、ycdH及yfiQ3個基因在不同處理時(shí)間都表達(dá)上調(diào)，尤其是在互作4 h左右表達(dá)顯著上調(diào)，可能是由于菌株在與黃瓜幼苗根系接觸一段時(shí)間后，黏附相關(guān)的蛋白才會大量表達(dá)。②除yczE在處理6 h后表達(dá)下調(diào)外，sfp、srfAA及comP3個基因在處理不同時(shí)間時(shí)整體都表達(dá)上調(diào)，尤其是在互作0.25～0.5 h左右，4個基因表達(dá)顯著上調(diào)，可能是由于表面活性素在菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期發(fā)揮作用，因此相關(guān)基因的表達(dá)水平在接觸初期會呈現(xiàn)顯著的上調(diào)。③efp、swrB及swrA3個基因隨著處理時(shí)間的增加表達(dá)水平由上調(diào)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橄抡{(diào)，可能是由于菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期其根系分泌物中的信號分子對菌株由趨化作用，菌株的群集運(yùn)動能力較強(qiáng)，基因表達(dá)水平上調(diào)；而隨著處理時(shí)間的增加，菌株逐漸黏附在植物根系，形成生物被膜，運(yùn)動能力下降，基因水平表達(dá)下調(diào)。④spo0A、sigH表達(dá)出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，而sinR表達(dá)出現(xiàn)逐漸下調(diào)的趨勢。3個全局調(diào)控因子表達(dá)水平的不同步可能是由于對照組(0 h)菌株沒有與植物根系接觸，環(huán)境相比于同根系共培養(yǎng)的菌株更為惡劣，刺激菌株產(chǎn)孢，因而導(dǎo)致初始對照組的spo0A表達(dá)水平上調(diào)；而隨著處理時(shí)間的增加，菌株逐漸在黃瓜根系黏附，開始形成生物被膜，因此表達(dá)水平下調(diào)。在處理時(shí)間8 h左右，sinR表達(dá)下調(diào)，epsA-O及yqxM-sipW-tasA這兩個操縱子表達(dá)均上調(diào)。但epsA的表達(dá)水平上調(diào)并不明顯，可能是處理時(shí)間較短造成的，此時(shí)epsA-O中其他基因可能參與了調(diào)控。根據(jù)這4類基因的轉(zhuǎn)錄水平差異，從分子的水平上檢測出了菌株在與黃瓜幼苗根系互作的過程中，發(fā)生了根際定殖的現(xiàn)象。

本試驗(yàn)采用水培黃瓜幼苗的方式建立的解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜根系互作的模型，雖然具有易于收集菌體、菌株及黃瓜幼苗受其他外界條件干擾小的優(yōu)點(diǎn)，且從短期培養(yǎng)結(jié)果上來看也比較接近菌株的定殖行為，但長期培養(yǎng)時(shí)其厭氧的水培環(huán)境不利于好氧微生物的生命活動，因此建立更為真實(shí)的模擬菌株與植物根系互作模型問題還有待解決。

4 結(jié)束語

通過對解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜互作過程的研究，確定了菌株能夠部分利用黃瓜根系分泌物的主要成分有機(jī)酸(檸檬酸、草酸、琥珀酸和蘋果酸)及氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和色氨酸)成分，且受到這些成分的趨化作用，其中對于蘋果酸和谷氨酸的利用情況及受趨化作用最優(yōu)。在建立了菌株與黃瓜幼苗互作模型后，通過計(jì)數(shù)的方式研究了菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量隨時(shí)間變化的關(guān)系，并且通過熒光定量PCR的方式，從與黃瓜根系互作后菌株與根際定殖、群集運(yùn)動、生物被膜形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異上分析，菌株具有在黃瓜幼苗根系表面定殖的能力，且菌株最大定殖量為1.02×105CFU/g。