血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平在乳腺癌中的臨床病理學(xué)意義及預(yù)后價值

羅俊波 鄭瑞鋒 王彥威 文海英 莊紅麗

乳腺癌是當(dāng)今危害女性健康的第一大腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首[1]。目前我國乳腺癌發(fā)病率為21.6/10萬，較10年前增長了近一倍[2]。近年來隨著醫(yī)療水平的提高，乳腺癌的總體5年生存率有所提高，但某些分子類型乳腺癌的預(yù)后仍不盡如人意，尤其是基底細(xì)胞型乳腺癌[3]。乳腺癌的預(yù)后取決于其分子類型與TNM分期，尋找可靠、穩(wěn)定且無創(chuàng)的早期篩查指標(biāo)無疑可為乳腺癌患者的治療贏得時間，對預(yù)后具有重要意義。近年來，關(guān)于基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在惡性腫瘤中也有重要發(fā)現(xiàn)[4-5]。MMP-2和MMP-9是一類重要的水解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，參與到腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移過程。Chan等[4]運用免疫組化技術(shù)在939例膀胱癌患者組織中同樣發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，癌組織中MMP-2的表達(dá)顯著升高，且MMP-2高表達(dá)者預(yù)后更差。Shi等[5]發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，子宮內(nèi)膜癌患者血清MMP-9水平顯著增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本研究通過對60例乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平進(jìn)行分析，旨在探究三者與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系及在乳腺癌患者預(yù)后評估中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月至2016年1月期間入我院就診的乳腺癌患者60例，所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診。乳腺癌分子分型的依據(jù)來自術(shù)中切除的腫瘤組織的免疫組化結(jié)果。乳腺癌的分期參照美國腫瘤聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第8版乳腺癌分期系統(tǒng)[6]，其中Luminal A 型19例、Luminal B型 16例、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)過表達(dá)型11例、基底細(xì)胞型14例，Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌38例、Ⅲ～Ⅳ乳腺癌22例。同期選取健康體檢者80例。乳腺癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①意識清楚，語言表達(dá)能力正常，能與調(diào)查人員進(jìn)行正常的溝通；②與研究者進(jìn)行研究目的溝通后，研究對象自愿參與本研究；排除標(biāo)準(zhǔn)：①已在外院接受放化療或免疫治療者；②急慢性感染、甲狀腺疾病、其他的良惡性腫瘤者；③患者或其家屬不愿意簽署知情同意書者。從患者入院開始對納入的60例乳腺癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪日期截止至2017年9月，隨訪時間為16～40個月。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 臨床資料采集

由專業(yè)人員收集所有納入對象的臨床資料如：年齡、吸煙史、飲酒史、體重指數(shù)(BMI)等，BMI計算方法為體重/身高2(kg/m2)。

1.3 臨床樣本采集與檢測方法

使用含促凝劑采血管抽取乳腺癌患者治療前及健康體檢者靜脈血10 ml。血清CA15-3的檢測采用化學(xué)發(fā)光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供，采用美國貝克曼庫爾特公司UniCel DxI 800分析儀進(jìn)行檢測。質(zhì)控品采用英國朗道公司腫瘤高、低值質(zhì)控品，質(zhì)控判斷標(biāo)準(zhǔn)為Westgard多規(guī)則分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測每組對象血清MMP-2和MMP-9水平，試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行，簡明步驟如下：所有標(biāo)本經(jīng)稀釋(1∶100)后依次加入微孔板中與抗體室溫孵育40 min(分別加入MMP-2濃度為200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL的4個標(biāo)準(zhǔn)品、陽性和陰性對照，MMP-9濃度為100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL的4個標(biāo)準(zhǔn)品、陽性和陰性對照)，洗板5次，在避光條件下加入酶標(biāo)記的單抗室溫孵育40 min，再洗板5次，加入底物反應(yīng)15 min后終止反應(yīng)，于Nanodrop ND2000分析儀(美國賽默飛世爾公司)上檢測吸光值(A)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床基本信息

所有研究對象的臨床基本信息，見表1。乳腺癌患者和健康體檢者之間在年齡、吸煙史、飲酒史、糖尿病史和BMI方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 研究對象血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平比較

乳腺癌患者和健康體檢者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平，見表2。與健康組相比，乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平均增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 60例乳腺癌患者和80例健康體檢者的臨床基本信息

表2 60例乳腺癌患者和80例健康體檢者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平

2.3 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

如表3所示，乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平與乳腺癌患者年齡、BMI、吸煙與否、飲酒與否等無顯著關(guān)系(P>0.05)，而與腫瘤的分子分型(與血清MMP-2、MMP-9和CA15-3的R2分別為0.296、0.285、0.283，P<0.001)、TNM分期(與血清MMP-2、MMP-9和CA15-3的R2分別為0.310、0.276、0.303，P<0.001)顯著相關(guān)。血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平在基底樣型乳腺癌患者中的增高最為明顯，其次為HER2陽性型。此外，三者在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者中的水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者(P<0.05)。

2.4 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3對乳腺癌的風(fēng)險評估

多元Logistic回歸分析結(jié)果，見表4。單因素分析顯示，MMP-2、MMP-9和CA15-3是乳腺癌的危險因素；多因素分析顯示，在校正年齡、吸煙、飲酒、糖尿病等因素影響后，MMP-2、MMP-9和CA15-3高表達(dá)是乳腺癌的獨立危險因素。

表3 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平與乳腺癌臨床病理特征間的關(guān)系

表4 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3等指標(biāo)對乳腺癌的預(yù)測價值

注：a校正年齡、吸煙、飲酒、糖尿病等因素影響。

2.5 生存分析

60例乳腺癌患者依據(jù)MMP-2、MMP-9和CA15-3水平的中位數(shù)分別被分為高M(jìn)MP-2與低MMP-2組、高M(jìn)MP-9與低MMP-9組和高CA15-3與低CA15-3組。同低MMP-2組相比，高M(jìn)MP-2組患者的生存時間顯著降低(log-rankP=0.026，圖1A)；同低MMP-9組相比，高M(jìn)MP-9組患者的生存時間顯著降低(log-rankP=0.012，圖1B)而高CA15-3與低CA15-3組間的生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(log-rankP=0.563，圖1C)。

圖1 生存分析

3 討論

依據(jù)2012年國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，我國乳腺癌總發(fā)病率約為43/10萬，其中城市為52/10萬，農(nóng)村為23/10萬[7-8]。近年來，雖然乳腺癌的死亡率在逐年下降，但其發(fā)病率卻在逐年升高。目前臨床上乳腺癌的診斷主要依賴于乳腺X線攝影、超聲和實驗室腫瘤標(biāo)記物指標(biāo)，然而都存在著敏感性低、特異度不高等問題。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)與診斷，是改善患者預(yù)后，提高生存率的有效方法。目前，乳腺X線攝影檢出乳腺癌敏感度為70%～75%，特異度約為65%，而超聲的敏感性和特異性均只有近60%[9]。因此，臨床上迫切需要找尋具有更高敏感性、特異度的生物標(biāo)記物。

實驗室診斷乳腺癌的指標(biāo)主要是CA15-3，而其敏感性只有約55%[10]。近年來國內(nèi)外多個研究報道指出血清MMP-2和MMP-9在重塑腫瘤微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、以及在腫瘤診斷及預(yù)后等評價中具有積極的價值[11-14]。MMP-2和MMP-9是一類重要的水解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，參與到腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以通過旁分泌途徑釋放MMP-2和MMP-9。Jiang等[11]發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中過表達(dá)鈣粘蛋白17可以顯著提高癌細(xì)胞釋放MMP-2，而MMP-2可通過NF-κB通路促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，并與患者預(yù)后不良相關(guān)。此外，Xu等[12]運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，與健康人相比胃癌患者血漿MMP-2基因的表達(dá)顯著升高。在子宮內(nèi)膜癌研究中，Zhang[13]發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中MMP-9可降低四氫大麻醇的表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Pietruszewska等[14]應(yīng)用免疫組化技術(shù)在210例頭頸部癌患者組織中同樣發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比癌組織中MMP-2與MMP-9水平顯著增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。然而，關(guān)于血清MMP-2和MMP-9對乳腺癌預(yù)后評估的臨床價值相關(guān)研究未見報道。因此，本研究我們通過對60例確診為乳腺癌患者外周血MMP-2和MMP-9進(jìn)行分析并隨訪，同時結(jié)合乳腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)記物CA15-3，旨在探討血清MMP-2、MMP-9和CA15-3在乳腺癌患者預(yù)后評估中的價值。

本研究我們發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，乳腺癌患者血清CA15-3、MMP-2和MMP-9水平均顯著增高，且血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平在基底樣型乳腺癌患者中的增高最為明顯，其次為HER2陽性型。此外，三者在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者中的水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者?；讟有腿橄侔┦菒盒猿潭茸罡叩囊活?，MMP-2、MMP-9和CA15-3水平的顯著提高提示三者在該亞型患者腫瘤發(fā)展中起重要作用。相關(guān)性分析顯示血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平與腫瘤的分子分型、TNM分期顯著相關(guān)，與前期多個學(xué)者在其他腫瘤中的發(fā)現(xiàn)相一致[11，13-14]，提示MMP-2、MMP-9和CA15-3可能參與乳腺癌的進(jìn)程中。多因素分析顯示，在校正年齡、吸煙、飲酒、糖尿病等因素影響后，高M(jìn)MP-2、高M(jìn)MP-9和高CA15-3是乳腺癌的獨立危險因素。最后，我們進(jìn)行了指標(biāo)的預(yù)后評估，發(fā)現(xiàn)高M(jìn)MP-2組和高M(jìn)MP-9組患者的生存時間顯著短于低MMP-2組和低MMP-9組患者，而血清高CA15-3與低CA15-3組間的生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示乳腺癌患者血清MMP-2和MMP-9水平在評估患者預(yù)后中具有潛在價值。然而，本次研究仍有如下不足：①本次研究納入的患者均來自于本院，這可能會對研究結(jié)果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊列研究來進(jìn)一步驗證我們的結(jié)果；②本研究納入60例乳腺癌患者，例數(shù)有限，后期需要更大樣本量的研究來證實血清MMP-2、MMP-9和CA15-3對我國乳腺癌患者的臨床價值。

通過本次實驗，我們發(fā)現(xiàn)血清MMP-2和MMP-9在評估乳腺癌患者預(yù)后中具有重要的臨床意義，有望為臨床乳腺癌患者的診療及預(yù)后改善提供新的途徑與思路。