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    影響脂肪組織工程中細(xì)胞外基質(zhì)支架的相關(guān)因素研究進(jìn)展

    2019-03-01 07:20:22曹婷劉毅
    中國(guó)美容醫(yī)學(xué) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:脂肪組織

    曹婷 劉毅

    [摘要]支架作為組織工程三要素之一,它主要是作為細(xì)胞臨時(shí)附著點(diǎn),其降解速度應(yīng)與組織再生速度相匹配,待組織重建后支架可降解排泄,不對(duì)人體造成任何損害。目前研究的組織工程支架主要有天然可降解高分子材料、人工合成的可降解高分子材料、無(wú)機(jī)材料等,脂肪組織脫細(xì)胞基質(zhì)支架作為近年來(lái)的研究熱門(mén),因其來(lái)源豐富、取材方便,受到研究者們的青睞,本文就影響脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的相關(guān)因素綜述如下。

    [關(guān)鍵詞]脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì);脫細(xì)胞組織基質(zhì);生物支架 ;脂肪組織;可降解性;活性物質(zhì)

    [中圖分類號(hào)]Q954.65+5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2019)01-0160-04

    Factors Affecting Adipose Tissue Extracellular Matrix Scaffold

    CAO Ting,LIU Yi

    (Department of Burn and Plastic Surgery ,the 940th of Joint Logistics Support Force of Chinese Peoples Liberation Army, Lanzhou 730050, Gansu,China )

    Abstract: As one of the three elements of tissue engineering, scaffold is mainly used as a temporary attachment point of cells. Its degradation rate should match the rate of tissue regeneration. After the tissue is reconstructed, the scaffold can be degraded and excreted without causing any damage to the human body. Currently, the tissue engineering scaffolds studied mainly include natural degradable polymer materials, synthetic degradable polymer materials, inorganic materials, etc. In recent years. adipose tissue decellularized matrix scaffolds have been studied popularly due to the advantages of its sources and convenience in materials. This article will review the correlative factors affecting the extracellular matrix scaffold of adipose tissue.

    Key words: adipose tissue extracellular matrix; acellulartissue matrix; biological scaffold; adipose tissue; degradability; active substance

    脫細(xì)胞組織基質(zhì) (Acellular Tissue Matrix, ACTM)是近年來(lái)軟組織缺損修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),通過(guò)使用物理、化學(xué)、生物的方法對(duì)組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理, 去除移植物的相關(guān)抗原,最大程度地保留細(xì)胞外的活性物質(zhì)及超微結(jié)構(gòu),獲得的生物衍生材料。目前已研發(fā)的ACTM包括脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、小腸黏膜下基質(zhì)、心包、心瓣膜、小口徑動(dòng)脈,泌尿系統(tǒng)的膀胱、輸尿管及尿道等。脂肪組織由于來(lái)源豐富,易于獲取,臨床應(yīng)用中不存在倫理學(xué)問(wèn)題,安全性能高,許多研究指出細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)可被完全降解,大約95%的降解產(chǎn)物通過(guò)尿液排出,幾乎無(wú)降解物被宿主吸收。脂肪組織脫細(xì)胞基質(zhì)不僅可作為組織工程的支架,亦可作為獨(dú)立的軟組織缺損填充物,有著巨大的應(yīng)用潛能。本文主要闡述影響脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的相關(guān)因素。

    1 脫細(xì)胞方法

    脫細(xì)胞的目標(biāo)是既要清除干凈組織中的細(xì)胞成分,徹底消滅組織的抗原性,又要最大程度地保留細(xì)胞外基質(zhì)的3D超微結(jié)構(gòu)、生物活性及組織的完整性。目前脫細(xì)胞方法主要有:物理機(jī)械法、化學(xué)法、生物法。Brown[1]等通過(guò)三種不同的脫細(xì)胞方法,表明不同脫細(xì)胞化方法制備的脫細(xì)胞脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)(decellularized adipose tissue extraeellular matrix,DAM)在結(jié)構(gòu)和生物、化學(xué)性能上的不同,因此,強(qiáng)調(diào)了脂肪組織脫細(xì)胞化方案的重要性。

    1.1 物理機(jī)械法:主要有凍融法(快速冷凍組織后,細(xì)胞內(nèi)冰晶形成,破壞細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞溶解,主要通過(guò)反復(fù)凍融以提高脫細(xì)胞的作用)、離心振蕩法[2](將黏附在組織上的血液等液體成分徹底洗滌干凈后,低速離心后高速勻漿、離心、凍干等程序后,可得到脂肪組織ECM成分)和壓力法[3],壓力法是在一定溫度下,將組織完全浸泡于磷酸鹽緩沖液中,其中含有一定量的葡聚糖,對(duì)其進(jìn)行緩慢加壓,使細(xì)胞完整性遭到破壞,造成細(xì)胞溶解。壓力法對(duì) ECM 非緊密排列的組織或器官效果已得到肯定。

    1.2 化學(xué)法:去細(xì)胞常用的化學(xué)方法包括低滲/高滲溶液、離子型/非離子型去污劑、酸/堿處理、螯合劑及有機(jī)溶劑萃取。酸和堿可以使細(xì)胞質(zhì)成分有效溶解并破壞核酸,但同時(shí)也能破壞其他物質(zhì),如細(xì)胞外基質(zhì)中的重要成分糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)。非離子洗滌劑如曲拉通(Triton)X-100)是脫細(xì)胞過(guò)程中研究及應(yīng)用較多的,且常與其它洗滌劑配合使用[4],如和十二烷基硫酸鈉(So-dium dodecyl sulfate,SDS)相配合,便可以起到比較好的脫細(xì)胞效果[5-6]。高、低滲液是通過(guò)滲透壓的變化使組織中細(xì)胞溶解。螯合劑,如常用的如乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)和乙二醇雙四乙酸(ethylene glycol bis(2aminoethyl ether)tet—raacetic acid,EGTA)。細(xì)胞與ECM黏附中會(huì)出現(xiàn)二價(jià)的陽(yáng)離子,螯合劑可在作用過(guò)程中形成印戒狀分子復(fù)合物,該復(fù)合物與二價(jià)陽(yáng)離子相結(jié)合,促使細(xì)胞與ECM分離。螯合劑在脫細(xì)胞過(guò)程中的作用主要是輔助金屬離子破壞蛋白與蛋白間的聯(lián)系。EDTA常常和胰蛋白酶聯(lián)合使用[7],但單獨(dú)使用螯合劑不能去除組織表面的細(xì)胞,因此,常與酶類或除垢劑相聯(lián)合,以達(dá)到較好的脫細(xì)胞效果。眾多研究者將生物、物理、化學(xué)三種方法與螯合劑聯(lián)合起來(lái)作用于成塊脂肪組織,使從中提取的脫細(xì)胞脂肪基質(zhì)能夠基本保持其原有的特異性,同時(shí)具有誘導(dǎo) ADSCs 成脂分化的能力[8-9]。

    特別是SDS已被證明可以與ECM形成強(qiáng)烈的相互作用,能夠改變基質(zhì)結(jié)構(gòu)。在研究開(kāi)始后,無(wú)論是SDS和脫氧膽酸鈉造成不可逆的降解和形成的腫脹結(jié)構(gòu)呈凝膠狀物質(zhì)。另外,SDS難以在處理結(jié)束后除去,并能顯著地影響細(xì)胞活力。也有實(shí)驗(yàn)直接使用交聯(lián)劑EX-810與蒸餾水和超聲相配合對(duì)組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理并取得成功[10],說(shuō)明交聯(lián)劑也具有脫細(xì)胞的作用。由于化學(xué)脫細(xì)胞處理法時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),不可避免地會(huì)有微生物污染,因此,許多去細(xì)胞處理方案中也加入青霉素、鏈霉素等抗生素,或者也可采用電子束照射、γ射線等方法對(duì)所得組織進(jìn)行滅菌處理[11]。

    1.3 生物法:主要為酶處理法。包括胰蛋白酶、脂肪酶、中性蛋白酶、核酸酶等。胰蛋白酶是脫細(xì)胞中常用的蛋白水解酶之一。一方面是因?yàn)樗軌蚱茐慕M織的亞顯微結(jié)構(gòu),可促進(jìn)隨后脫細(xì)胞試劑對(duì)組織的滲透,因此,常作為脫細(xì)胞程序中的第一步。另外,它是一種特異度比較高的蛋白水解酶,能特異性切斷賴氨酸和精氨酸C端的多肽鍵(鄰位不是脯氨酸情況下)。其最適溫度為37℃,而對(duì)于相同的試劑,作用的時(shí)間、順序和方法不同也會(huì)造成不同的結(jié)果。脫細(xì)胞方案中極小的差別也會(huì)大大影響脫細(xì)胞效果及所得組織性狀,最適pH為8.0。雖然目前胰酶在脫細(xì)胞方案中經(jīng)常用到,但它的脫細(xì)胞效果一般,特別對(duì)較厚的組織,胰酶無(wú)法完全清除組織深部的細(xì)胞成分[12-14]。胰蛋白酶對(duì)組織也有副作用,對(duì)ECM會(huì)有不同程度的破壞,其程度與作用時(shí)間成正比[15]。胰酶不會(huì)影響組織中的膠原含量。相關(guān)研究證明彈性組織與胰蛋白酶/EDTA的作用時(shí)間越長(zhǎng),彈性蛋白和糖胺聚糖含量就會(huì)大量減少,甚至?xí)⒔M織的抗張強(qiáng)度減少50%[16]。因此,要減少胰蛋白酶對(duì)ECM的副作用,就要盡量縮短胰蛋白酶的作用時(shí)間。核酶主要作用是引起DNA/RNA的降解,磷酸酯酶A2主要作用為水解細(xì)胞的磷脂成分。

    此外,相同的脫細(xì)胞方案對(duì)不同的組織效果不盡相同,脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法完全決定了所得到的組織細(xì)胞外基質(zhì)天然結(jié)構(gòu)及功能的保留程度,在脫細(xì)胞程度最大化前提下,最大可能的保存細(xì)胞外基質(zhì)的生理結(jié)構(gòu)和生物活性,是制備脫細(xì)胞生物材料的最終目標(biāo)。

    Flynn[17]結(jié)合物理、化學(xué)、生物等脫細(xì)胞方法。首先將樣品在冷凍緩沖溶液進(jìn)行凍融三個(gè)周期(-80℃~37℃),接著用胰蛋白酶消化溶解并用99.9%異丙醇進(jìn)行極性溶劑提取,去除脂質(zhì)含量后繼續(xù)在酶溶液中消化兩次。后用DNaseII型(從牛胰臟提?。┘癛NaseⅢ型A(來(lái)自牛胰臟)和VI-S型脂肪酶處理后,再次在99.9%的異丙醇的極性溶劑中提取。得到的組織結(jié)構(gòu)幾乎是保存完好的。Masson染色證實(shí)了脫細(xì)胞的有效性,LN和CIV電鏡下可見(jiàn)整體ECM的超微結(jié)構(gòu)在經(jīng)過(guò)加工后是保存完整的。即使高倍率下,微小的纖維化膠原蛋白結(jié)構(gòu)完整,這表明此脫細(xì)胞方案對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)造成的損傷很小。接種ASC并培養(yǎng)24h后行組織學(xué)分析表明ASC分布良好,廣泛附著并分布在支架上。Suto[18-21]等研究發(fā)現(xiàn)在軟骨、骨等組織工程中采用反復(fù)凍融技術(shù)可有效脫細(xì)胞,且對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性能無(wú)顯著影響,且與凍融循環(huán)次數(shù)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。范雪嬌[22]等人考慮到化學(xué)試劑及生物酶處理時(shí)間較長(zhǎng),可能影響材料的性能,將Flynn法中的凍融次數(shù)由3次增至5次;將胰蛋白酶作用的22h及異丙醇的56h分別縮短至12h和44h,將對(duì)組織的總處理時(shí)間由5d縮短至4d;并將除凍融外的余作用過(guò)程均采用低速震蕩,以促進(jìn)脫細(xì)胞液與組織充分作用。經(jīng)各項(xiàng)檢測(cè)并證實(shí)此改良方法可行。宋玫[23]將脂肪組織反復(fù)凍融5次,異丙醇提取12h,胰蛋白酶、DNase-I,RNase-A處理4h后所得到的組織經(jīng)檢測(cè)及種植于大鼠皮下均獲得成功。田亞菲[24]等將脂肪組織脫細(xì)胞后與人脂肪干細(xì)胞黏附、培養(yǎng),并于大鼠體內(nèi)移植證實(shí)了得到的人ACAM具有良好的組織相容性和可降解性,適于細(xì)胞增殖及分化;聯(lián)合人ADSCs在小鼠體內(nèi)能夠成功生成成熟的脂肪組織,可作為一種理想的組織工程支架。

    2 影響脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的因素

    2.1 脫細(xì)胞藥物對(duì)DAM的影響:Brown等[1]研究表明每次脫細(xì)胞方法產(chǎn)生的脂肪ECM支架結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性等不同,強(qiáng)調(diào)用于產(chǎn)生脂肪ECM支架的去細(xì)胞化方案的重要性。Lumpkins等[25-26]報(bào)道稱異丙醇脫脂效果雖好,但它會(huì)與膠原蛋白及黏多糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),使材料表面特性改變;胰蛋白酶具有一定脫細(xì)胞效果,但也會(huì)一定程度的破壞細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白和彈性蛋白,影響材料黏彈性[26-27]。Crapo等[27-28]證實(shí)材料微結(jié)構(gòu)改變會(huì)影響種子細(xì)胞的黏附、增殖等細(xì)胞相容性,并且此副反應(yīng)與作用時(shí)間成正相關(guān)性。

    2.2 支架對(duì)細(xì)胞的影響:脂肪組織支架可影響種子細(xì)胞的黏附及生長(zhǎng)發(fā)育,而不同的材料成分和納米結(jié)構(gòu)對(duì)干細(xì)胞的增殖、分化產(chǎn)生的影響也不同。Wu等[29]將脫細(xì)胞所得的脂肪基質(zhì)生物支架與脂肪干細(xì)胞復(fù)合后證實(shí)該支架可以支持干細(xì)胞的增殖并且具有促使其向脂肪細(xì)胞分化的作用。將此基質(zhì)植入大鼠皮下,發(fā)生較輕微的炎癥反應(yīng),且移植后的區(qū)域生成的脂肪組織同時(shí)血管化,周圍細(xì)胞長(zhǎng)入基質(zhì)中。相關(guān)研究證實(shí)支架硬度除了影響細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞行為,也影響細(xì)胞基因的表達(dá)[30-31]。支架微形態(tài)也影響著細(xì)胞的形態(tài)和功能。Kulangara等[32]制備3D支架并將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植于支架進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移速度明顯較 2D平面的細(xì)胞快。Oh等[33]使用離心分離法制備梯度孔徑的支架材料,與不同類型細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),觀察到不同的支架孔徑中生長(zhǎng)了不同的細(xì)胞,如軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞主要分布于380~405μm,成纖維細(xì)胞主要分布于186~200μm孔徑,骨細(xì)胞主要分布于290~310μm孔徑。真空冷凍干燥技術(shù)可用于三維多孔生物支架成型,目前主要用于聚合物乳液、多聚糖、水凝膠等材料的支架成型,它以可生物降解的聚合物溶液為對(duì)象,以純水凍結(jié)后的冰晶為孔隙源,凍干后的支架孔隙率為91%~95%、孔徑范圍為20μm~200m,且內(nèi)部連通性好[34]。

    2.3 交聯(lián)劑對(duì)DAM的影響:交聯(lián)劑可抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),可能因?yàn)榻?jīng)交聯(lián)劑處理的組織,其基質(zhì)蛋白之間形成了阻礙炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的障礙,并且經(jīng)交聯(lián)的基質(zhì)蛋白,可耐受蛋白酶的降解[35]。交聯(lián)劑在脫細(xì)胞過(guò)程中,會(huì)改變支架的機(jī)械性能。因此交聯(lián)劑處理的支架,不但抵抗了脫細(xì)胞過(guò)程的破壞,也能脫細(xì)胞和封閉抗原。直接使用交聯(lián)劑EX-810配合蒸餾水和物理超聲脫細(xì)胞成功[10],不但說(shuō)明交聯(lián)劑也是一種脫細(xì)胞試劑,也證實(shí)了交聯(lián)基質(zhì)會(huì)增加組織對(duì)酶降解的抗性,也就是交聯(lián)劑可以在一定程度上延長(zhǎng)人脂肪組織脫細(xì)胞基質(zhì)在體內(nèi)的停留時(shí)間。Brown[37]等研究表明,相同材料,脫細(xì)胞徹底的支架較大量細(xì)胞存在的支架相比較,新生組織瘢痕前者較后者明顯減輕。

    3 DAM對(duì)組織血管再生的影響

    組織工程的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)功能性再生受損或缺失的組織。巨噬細(xì)胞在組織移植中具有重要作用,在植入生物支架的新血管形成方面,巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌血管生成因子,在序貫激活M1和M2表型巨噬細(xì)胞過(guò)程中起關(guān)鍵作用。特別是已經(jīng)證明M1巨噬細(xì)胞可以引發(fā)血管發(fā)芽而M2巨噬細(xì)胞亞型刺激周圍細(xì)胞募集,吻合口和血管重塑[38]。巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在血管再生中發(fā)揮著非常重要的作用。M1、M2巨噬細(xì)胞除促進(jìn)血管形成外,分泌的促血管生成因子如VEGF、PDGF、TGF-β和bFGF等還可刺激間質(zhì)干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞等轉(zhuǎn)化,成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞可在缺損處形成肉芽組織促進(jìn)傷口愈合[39]。Badylak及其同事證明了脫細(xì)胞生物支架可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化朝著更具建設(shè)性的表型,這種轉(zhuǎn)變是于組織方面更有利的結(jié)果轉(zhuǎn)變[40-41]。

    另外,脂肪細(xì)胞外基質(zhì)材料具有極好的可塑性,可制成片狀、管狀、粉末狀等形態(tài),并可通過(guò)控制凍存的溫度來(lái)調(diào)節(jié)基質(zhì)材料孔徑的大小[42-43]。

    4 結(jié)語(yǔ)

    脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架展示了它在組織工程方面巨大的應(yīng)用潛力。目前,安全無(wú)毒、徹底的、可最大程度地保留細(xì)胞外活性物質(zhì)及三維結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞方法成為研究熱門(mén)及難點(diǎn),作為組織工程細(xì)胞支架的生物材料 ,一般必須具有良好的生物相容性、生物可降解性、細(xì)胞相容性、一定的力學(xué)性能、可加工性及可滅菌性[44]。隨著生活水平的提高,抽脂術(shù)及腹壁整形等手術(shù)的盛行,廢棄的脂肪組織等所制備的自體組織生物支架在仿生結(jié)構(gòu)、可塑性、免疫原性等方面都大大優(yōu)于非自體組織來(lái)源的生物材料。而目前已成功商品化的脫細(xì)胞真皮基質(zhì),成功應(yīng)用于臨床的小腸黏膜下基質(zhì)、心血管系統(tǒng)的心包、心瓣膜、泌尿系統(tǒng)的膀胱、輸尿管、尿道等,預(yù)示著DAM成功應(yīng)用于臨床指日可待。

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