脂肪組織石蠟切片制作方法探討

梁忠泉 ，劉暢，楊志娜，謝永新 ，袁昌隆*

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)北戴河康復(fù)療養(yǎng)中心1檢驗(yàn)病理科，2全軍腎病中西醫(yī)結(jié)合治療中心病理實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島066100）

脂肪組織在日常病理工作中非常常見，如脂肪瘤、胃腸道切取的大網(wǎng)膜，乳腺癌周圍以及淋巴結(jié)周圍脂肪組織等。脂肪組織是由大量群集的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，脂肪細(xì)胞間質(zhì)很少，是一種特殊的結(jié)締組織[1]。脂肪組織細(xì)胞內(nèi)含有大的脂滴，細(xì)胞間缺乏纖維和血管，脂肪組織經(jīng)常規(guī)處理后組織和石蠟不能很好的融合在一起，質(zhì)地松軟，蠟塊在常溫下表面易塌陷，很難制作成一張優(yōu)良的病理切片，給病理閱片、后續(xù)研究帶來(lái)一定困難。為了解決這一問題，我們?cè)诓挥绊懻９ぷ?、不增加工作時(shí)間和工作量的情況下不斷探索，提高了脂肪組織的制片質(zhì)量。

材料與方法

1 脂肪組織的來(lái)源

脂肪組織標(biāo)本主要來(lái)源于我院外科手術(shù)標(biāo)本，如脂肪瘤、多發(fā)性脂肪瘤、胃腸道惡性腫瘤切下的大網(wǎng)膜、乳腺癌乳腺根治標(biāo)本、淋巴結(jié)周圍的脂肪組織等。

2 試劑與設(shè)備

中性甲醛固定液（中性甲醛液的配制：取10%的甲醛液，加入碳酸鎂至飽和，PH7.6）[2]，95%乙醇，無(wú)水乙醇，環(huán)保透明脫蠟液（北京中杉金橋公司），石蠟（上海華永石蠟有限公司，熔點(diǎn)56～58℃），自動(dòng)組織脫水機(jī)（湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司），組織包埋機(jī)（天津航天機(jī)電有限公司），LEICA-RM2135切片機(jī)，烘片機(jī)，攤片機(jī)，Harris蘇木素染液，伊紅染液等（染液均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

3 脂肪組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟

將隨時(shí)送檢的脂肪組織標(biāo)本用取材刀從中間切開，特別大的可以多切兩刀，然后固定于中性甲醛液中，每天上午取材時(shí)再將脂肪組織切取為2cm×1cm×0.3cm大小，放入微孔塑料包埋盒中，置自動(dòng)組織脫水機(jī)上固定、脫水、透明、浸蠟，并改良機(jī)器各步驟的時(shí)間設(shè)置（表1）。

表1 改良前后固定、脫水、透明及浸蠟程序設(shè)定的比較Tab.1 Comparison of the fixation, dehydration, transparency and paraffin immersion process before and after optimization

4 肪組織的包埋

用眼科彎鑷子將脂肪組織從微孔塑料包埋盒中取出，置于組織包埋機(jī)工作臺(tái)加熱板上，將眼科彎鑷子在酒精燈上烤5s～6s, 然后用彎鑷子在脂肪組織上從左到右從上到下來(lái)回輕輕均勻按壓，直至將脂肪組織中的脂滴完全擠出為止（圖1A），將擠壓過的脂肪組織包埋制作成蠟塊。

5 脂肪組織石蠟切片、染色

將包埋好的蠟塊修切好后放在冷臺(tái)上或冰箱內(nèi)冷凍幾分鐘，LEICA-RM2135切片機(jī)切片，切片厚度5μm, 攤片機(jī)水槽內(nèi)溫度38℃～39℃（水槽中勿加酒精），烤片機(jī)溫度調(diào)為60℃，將切片先樹立在攤片機(jī)旁，待另一張切好后再平放烤片，以此類推，烤片時(shí)間15min～20min，常規(guī)蘇木素 、伊紅染色，環(huán)保中性快干膠封片，鏡下觀察。

結(jié) 果

經(jīng)過以上程序和方法處理的脂肪組織蠟塊無(wú)塌陷，組織和石蠟?zāi)芎芎玫娜诤显谝黄穑衅暾?，無(wú)空洞、無(wú)擠壓（圖1B）、水槽中展片時(shí)蠟帶完整，經(jīng)蘇木素、伊紅染色后鏡下觀察脂肪組織厚薄均勻，結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞無(wú)擠壓無(wú)重疊。形態(tài)清晰，著色均勻（圖2B、2C）。

討 論

脂肪組織石蠟切片往往是技術(shù)人員非常頭痛的事，特別是年輕技術(shù)員，組織經(jīng)過常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后質(zhì)地松軟，切片非常困難，易出現(xiàn)空洞，破碎等情況，甚至難以切片，究其原因是脂肪組織本身結(jié)構(gòu)和細(xì)胞特性所致。脂肪組織是由大量群集的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，而脂肪瘤則是由正常脂肪細(xì)胞增生而成，脂肪細(xì)胞的胞漿內(nèi)含大量脂滴，有機(jī)溶劑不易滲透[3]，從而造成組織固定不充分，脫水透明不足，浸蠟滲透不完全等情況出現(xiàn)。當(dāng)然脂肪組織可以通過長(zhǎng)時(shí)間的充分固定，延長(zhǎng)脫水、透明、浸蠟時(shí)間使脂滴完全溶解，石蠟充分滲入脂肪細(xì)胞和纖維組織中，由此做出的蠟塊質(zhì)地均勻從而能制作出優(yōu)良的切片，但在病理科的實(shí)際工作中沒有充足的時(shí)間也不可能將脂肪組織標(biāo)本挑出來(lái)單獨(dú)處理，除非是科研需要。

圖1 A，在加熱板上擠壓脂肪組織標(biāo)本； B，經(jīng)改良方法處理的脂肪組織蠟塊和切片；C，未經(jīng)改良方法處理的脂肪組織蠟塊和切片F(xiàn)ig. 1 A, extruding uniformly the adipose tissue specimen with elbow tweezers on the hot plate; B, the wax blocks and paraffin sections of the adipose tissues treated by improved methods. C, the wax blocks and paraffin sections of the adipose tissues without improved methods

圖2 A，未經(jīng)改良方法處理的脂肪組織的光鏡下觀察；B和C，經(jīng)改良方法處理的脂肪組織的光鏡下觀；比例尺，100μmFig. 2 A, light microscopic view of the adipose tissues without improved methods; B and C, light microscopic view of the adipose tissues with improved methods; scale bar, 100μm

為了在不影響正常工作的情況下做出優(yōu)質(zhì)的脂肪組織切片，本研究中，首先我們采用中性甲醛液作為組織標(biāo)本的固定液，由于加入了碳酸鎂，pH7.6左右略顯弱堿性，脂肪組織中的脂肪酸為酸性，根據(jù)酸堿中和的原理，以及甲醛具有穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)有利于組織的固定。此外，在收到標(biāo)本時(shí)就將標(biāo)本剖開，從而加強(qiáng)了組織的固定，避免了脂肪瘤因?yàn)橛型暾陌?，不利于固定液的穿透，影響脂肪組織充分固定的情況。

其次，在有脂肪組織標(biāo)本時(shí)把取材時(shí)間提前到上午進(jìn)行，將脫水機(jī)程序設(shè)定為中性甲醛固定液固定6h，95%乙醇Ⅱ2.5h，無(wú)水乙醇Ⅲ2.5h，環(huán)保透明液Ⅱ1.5h。由于增加了組織固定、脫水、透明時(shí)間，使組織得到充分固定，有利于有機(jī)溶劑對(duì)脂肪組織中脂滴的溶解，從而增加了組織的硬度，有利于切片。安排在上午取材的好處是不增加工作量，也不影響第2天的包埋切片等其他工作。

通過增加固定時(shí)間、延長(zhǎng)脫水、透明、浸蠟時(shí)間等方法脂肪組織內(nèi)的脂滴減少，對(duì)于殘余的脂滴我們?cè)诎襁^程中將組織置于組織包埋機(jī)工作臺(tái)加熱板上，加熱板上溫度足以使脂肪組織內(nèi)的脂滴呈液態(tài)，用眼科彎鑷子在酒精燈上加熱，然后在脂肪組織上輕輕均勻按壓，將脂肪組織中沒有溶解掉的脂滴盡可能擠出。通過按壓可能對(duì)脂肪組織的細(xì)胞膜造成輕微損傷，脂滴從細(xì)胞膜小的裂隙處擠出。脂肪組織中除含有大量的脂滴外還含有不同程度的結(jié)締組織、血管、平滑肌、膠原纖維等[4]，可以造成包埋后的組織硬度不一，若脂肪組織含量少其他組織含量多則切片順利，反之則切片困難。通過按壓可以使整塊脂肪組織變得比較致密結(jié)實(shí)[5,6]。按壓不僅擠出了脂滴，也擠出了浸入組織細(xì)胞內(nèi)的蠟液，在包埋時(shí)由于脂肪組織細(xì)胞內(nèi)存在一定的負(fù)壓，蠟液通過細(xì)胞膜輕微的裂隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞膜反彈而恢復(fù)細(xì)胞原有形態(tài)，脂肪組織經(jīng)過充分的固定、脫水、透明、浸蠟和包埋時(shí)的均勻擠壓，增加了脂肪組織的硬度，使組織和石蠟?zāi)芎芎玫娜诤显谝黄穑M織蠟塊質(zhì)地均勻，有利于切出完整的厚薄均勻的石蠟切片，提高了制片質(zhì)量，為病理診斷和后續(xù)研究提供了前提條件。鏡下觀察脂肪組織細(xì)胞呈圓形或多邊形，胞質(zhì)由于脂滴被溶解或擠出而呈大的空泡狀，胞核呈扁圓形，位于細(xì)胞一側(cè)。經(jīng)多年應(yīng)用觀察，均勻擠壓組織不會(huì)對(duì)脂肪組織的鏡下結(jié)構(gòu)造成明顯改變，且能很好的保持抗原，不影響最終的病理診斷。

最后，在切片前我們將制作好的蠟塊放在冷臺(tái)上或冰箱內(nèi)冷凍，其目的是進(jìn)一步增加蠟塊和組織的硬度，在撈片時(shí)水槽內(nèi)的溫度控制在38～39℃之間且不加入乙醇。水溫過高組織蠟帶易散，加入乙醇后水面張力增加，組織蠟帶更容易迅速散開，造成無(wú)法撈片。

通過一系列方法的改進(jìn)，我們很好地解決了脂肪組織的制片問題，使包埋后的脂肪組織中很少含有脂滴甚至無(wú)脂滴，制作的蠟塊無(wú)塌陷（圖1B），切片順利完整，組織結(jié)構(gòu)層次清晰。

總之，作為技術(shù)人員，要認(rèn)真學(xué)習(xí)，不斷實(shí)踐，勇于創(chuàng)新，把病理技術(shù)工作做精，著名病理學(xué)家Karl Lennert 教授曾說“技術(shù)是病理之母”，是推動(dòng)科學(xué)發(fā)展的動(dòng)力，一張優(yōu)良的脂肪組織切片是病理診斷和科研的前提和基礎(chǔ)[7,8]。熟練掌握脂肪組織的特殊結(jié)構(gòu)，充分的固定，在不影響正常工作，不增加工作量的情況下適當(dāng)延長(zhǎng)組織的脫水、透明、浸蠟時(shí)間，盡可能的讓有機(jī)溶劑將脂滴溶解，再加上包埋時(shí)將脂滴擠出，通過這些方法的改進(jìn)制作出優(yōu)良的切片。