鹽酸法脫酰胺結(jié)合酶解制備高攜鈣能力鴨蛋蛋清肽

高琦，許燕玲，趙夢鴿，朱必洋，何慧

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

在中國和東南亞地區(qū)，鴨蛋的消費(fèi)量約占蛋制品消耗總量的30%[1]，但咸鴨蛋清是食品生產(chǎn)過程中利用咸蛋黃之后產(chǎn)生的下腳料，由于咸度太高等原因，利用受限，常常被丟棄，造成了優(yōu)質(zhì)蛋白資源的極大浪費(fèi)。因此，將咸鴨蛋清合理利用，并使其增值是一個(gè)值得研究的課題。蛋白質(zhì)經(jīng)脫酰胺改性后，使其中天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轸然瑢?dǎo)致其配位基團(tuán)增多[2]。目前，關(guān)于蛋白質(zhì)脫酰胺的方法主要包括酸法[3]、堿法[4]和酶法[5-6]3種。其中對于酸法脫酰胺的研究較多，且多集中于通過脫酰胺改善蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、持水性等功能性質(zhì)方面的研究[7]，而以獲得更多鈣結(jié)合位點(diǎn)為目的,對蛋白進(jìn)行鹽酸法脫酰胺的研究目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

在提高蛋白或多肽攜鈣能力方面的研究中，對多肽直接進(jìn)行脫酰胺修飾的研究較多，且研究發(fā)現(xiàn)，對肽進(jìn)行脫酰胺修飾是提高其攜鈣能力的有效手段，酪蛋白以及大豆肽經(jīng)脫酰胺修飾所得產(chǎn)物的Ca2+螯合能力明顯提高[8-9]。趙寧寧等[10]曾采用谷氨酰胺酶對鴨蛋蛋清肽進(jìn)行脫酰胺改性，其改性產(chǎn)物的可溶性鈣結(jié)合量達(dá)7.51 mgCa/g肽，相比于未脫酰胺改性的鴨蛋蛋清肽(5.84 mgCa/g肽)提升了21.58%，且通過紅外光譜的結(jié)果證實(shí)鴨蛋清肽中的羧基是Ca2+的有效結(jié)合位點(diǎn)。此外，袁興宇等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大豆肽與鈣的結(jié)合位點(diǎn)主要是其肽鏈中天冬氨酸及谷氨酸上的羧基。脫酰胺反應(yīng)中，在天冬酰胺和谷氨酰胺轉(zhuǎn)變成天冬氨酸和谷氨酸的過程中，蛋白質(zhì)鏈上的羧基不斷增多；而體系中的羧基越多(即脫酰胺程度越高)，與Ca2+結(jié)合的位點(diǎn)越多，從而使其鈣結(jié)合能力越強(qiáng)。目前對于促鈣吸收肽的修飾方面的研究多集中于對多肽直接修飾，而先對蛋白進(jìn)行脫酰胺改性，再將脫酰胺蛋白酶解制肽，從而提高其產(chǎn)物攜鈣能力的研究目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究首先用電滲析法[12]使咸鴨蛋清脫鹽，再利用鹽酸對鴨蛋蛋清蛋白進(jìn)行脫酰胺處理，并以脫酰胺度為指標(biāo)，優(yōu)化了鴨蛋蛋清蛋白的脫酰胺反應(yīng)條件，得到具有高脫酰胺度的鴨蛋蛋清蛋白。再對脫酰胺蛋清蛋白進(jìn)行酶解，旨在制得具有高攜鈣能力的脫酰胺鴨蛋蛋清肽，為咸鴨蛋清的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鴨蛋清，湖北神丹健康食品有限公司提供；苯酚、亞硝基鐵氰化鈉、氫氧化鈉、次氯酸鈉溶液、硫酸銨、濃鹽酸、硼酸、濃硫酸、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、氧化鑭、硝酸、高氯酸，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

小型實(shí)驗(yàn)用特種電驅(qū)動膜分離器，浙江千秋環(huán)保水處理有限公司；PB-10 Sartorius標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)，德國賽多利斯股份公司；Prepscale 1.6L超濾設(shè)備，美國Millipore公司；截留分子質(zhì)量為1、3、5、6 kDa的中空卷式再生纖維素膜包(膜面積均為0.09 m2)，美國Millipore公司；AA-6300C原子吸收分光光度儀，日本島津公司；UV-1750紫外可見分光光度計(jì)，日本Shimadza公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 咸鴨蛋蛋清蛋白的提取

參照趙寧寧的方法制備脫鹽鴨蛋蛋清蛋白粉，置于干燥皿中備用[10]。

1.3.2 鴨蛋蛋清蛋白的鹽酸法脫酰胺處理

將鴨蛋蛋清蛋白分散于一定濃度的鹽酸溶液中，配制成蛋白濃度為3%的蛋白分散液，在一定的溫度下進(jìn)行脫酰胺反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)液，并用10 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至中性，考察鹽酸濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間等因素對蛋清蛋白脫酰胺度的影響。

1.3.3 脫酰胺度的測定

通過對樣品溶液中的游離氨濃度進(jìn)行測定，進(jìn)而計(jì)算出反應(yīng)后樣品的脫酰胺度。參照文獻(xiàn)[8]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定。

總酰胺含量的測定：參照文獻(xiàn)[13]的測定方法。脫酰胺度的計(jì)算公式如下：

(1)

1.3.4 脫酰胺鴨蛋蛋清肽的制備

1.3.4.1 脫酰胺蛋清肽的制備流程

脫酰胺蛋清蛋白粉→按一定料液比加蒸餾水→沸水浴攪拌30 min→冷卻后放入恒溫水浴磁力攪拌器中→設(shè)定溫度為所需用酶的最適溫度，并調(diào)至該酶的最適pH→加一定量的酶→滴加1 mol/L NaOH使酶解過程中pH維持在最適條件，并記錄堿消耗量→沸水浴滅酶15 min→冷卻后離心(3 800 r/min，15 min)→將上清液旋蒸、凍干得到脫酰胺蛋清肽→測定可溶性鈣結(jié)合量

以水解度和可溶性鈣結(jié)合量為指標(biāo)，考查5種蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶)對脫酰胺蛋清蛋白的酶解效果。5種蛋白酶的最適反應(yīng)條件(廠家推薦值)見表1。

1.3.4.2 水解度(DH)測定

采用pH-stat法計(jì)算水解度：

(2)

其中，Htot即原料蛋白中的肽鍵數(shù)，對鴨蛋清而言取11.1 mmol/g。

表1 蛋白酶的最適反應(yīng)條件Table 1 The optimal reaction conditions of the selectedproteases

1.3.4.3 可溶性鈣結(jié)合量的測定

將20 mmol/L pH7.8的磷酸緩沖液與5 mmol/L的CaCl2溶液按一定比例混合，在37 ℃下水浴加熱15 min生成CaCO3沉淀，再加入一定量的脫酰胺蛋清肽，在37 ℃下恒溫2 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，10 000 r/min離心15 min，取4 mL上清液并加入20 mL混合酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)，在220～250 ℃電熱板上加熱進(jìn)行消化，直至消化液清亮，加入5 mL去離子水趕酸。待消化液剩余2～3 mL時(shí)，取下冷卻，用20 g/L的氧化鑭定容到50 mL，用0.22 μm的水系濾器過濾后用原子吸收法測定離子鈣含量。

1.3.4.4 不同級分脫酰胺蛋清肽結(jié)合鈣能力比較

用截留分子質(zhì)量分別為6 k、5 k、3 k、1 kDa的超濾膜將脫酰胺鴨蛋清蛋白酶解液(正交試驗(yàn)最優(yōu)條件下制得)分成5個(gè)不同分子質(zhì)量的級分，即>6 kDa、5～6 kDa、<5 kDa、<3 kDa、<1 kDa，旋蒸后冷凍干燥，用原子吸收分光光度法分別測定不同級分的脫酰胺蛋清肽的鈣結(jié)合能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸法脫酰胺單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對鴨蛋蛋清蛋白脫酰胺度的影響

在蛋白含量為3%，鹽酸濃度0.3 mol/L，反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，考察溫度對蛋清蛋白脫酰胺度的影響，結(jié)果如圖1所示。鴨蛋蛋清蛋白的脫酰胺度隨著溫度的升高逐漸增大，溫度為70～80 ℃時(shí)，脫酰胺程度增加緩慢；當(dāng)溫度升到80 ℃以上時(shí)，蛋清蛋白的脫酰胺程度增大更加明顯。這可能是由于脫酰胺反應(yīng)涉及天冬酰胺和谷氨酰胺的殘基側(cè)鏈上酰胺基團(tuán)化學(xué)鍵的斷裂[14](脫酰胺)，此過程需消耗較高能量，因此，反應(yīng)溫度越高，蛋清蛋白的脫酰胺度越高，該結(jié)果與鄭建冰等[15]對大米蛋白進(jìn)行脫酰胺改性的研究結(jié)果一致。

圖1 溫度對脫酰胺度的影響
Fig.1 The effect of temperatures on the deamidization
degrees

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對鴨蛋蛋清蛋白脫酰胺度的影響

在蛋白含量為3%，鹽酸濃度0.3 mol/L，溫度70 ℃的條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對蛋清蛋白脫酰胺度的影響，結(jié)果如圖2所示。鴨蛋蛋清蛋白的脫酰胺度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增大再逐漸減小的趨勢。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2～5 h時(shí)，蛋清蛋白的脫酰胺度明顯增大，當(dāng)繼續(xù)反應(yīng)達(dá)到6、7 h時(shí)，脫酰胺度的變化不明顯，因此選用反應(yīng)時(shí)間為5 h較為合適。

在20世紀(jì)的70～80年代期間，我國針對城市污水濕地問題陸續(xù)開展相關(guān)技術(shù)項(xiàng)目，并得出多種有效的凈化工藝方法，建立規(guī)模不同的示范工程。研究發(fā)現(xiàn)，采用蘆葦濕地系統(tǒng)的策略，對進(jìn)一步降低污水中的有機(jī)污染物，凈化水系統(tǒng)，降低N、P等營養(yǎng)物，降低重金屬等都具有顯著效果。作為一項(xiàng)投資較少且見效快的項(xiàng)目，蘆葦濕地系統(tǒng)同時(shí)具備后期維護(hù)運(yùn)行成本低、操作方法相對較為便捷的優(yōu)點(diǎn)，是對城市污水進(jìn)行二次處理及利用的一種有效方法。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對脫酰胺度的影響
Fig.2 The effect of reaction time on the deamidization degrees

2.1.3 鹽酸濃度對鴨蛋蛋清蛋白脫酰胺度的影響

在蛋白含量為3%，溫度70 ℃，反應(yīng)時(shí)間4 h，考察鹽酸濃度對蛋清蛋白脫酰胺度的影響，結(jié)果如圖3所示。鴨蛋蛋清蛋白的脫酰胺度隨著鹽酸濃度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，鹽酸濃度較低時(shí)，酰胺基團(tuán)轉(zhuǎn)化為羧基的數(shù)量較少，當(dāng)鹽酸濃度為0.4 mol/L時(shí)，脫酰胺度最高，鹽酸濃度過高時(shí)，脫酰胺度反而下降。這是因?yàn)樵诘鞍酌擋０返倪^程中會伴隨著肽鍵的斷裂，過高的鹽酸濃度除了催化脫酰胺外，同時(shí)還會對(主鏈上)肽鍵的斷裂起到催化作用[16]，故使其脫酰胺度不一定增大，該結(jié)果與胡慶玲等[17]對小麥面筋蛋白進(jìn)行鹽酸法脫酰胺的研究結(jié)果一致。因此，選擇鹽酸濃度為0.4 mol/L較為合適。

圖3 鹽酸濃度對脫酰胺度的影響
Fig.3 The effect of hydrochloric acid concentration on
the deamidization degrees

2.2 鹽酸脫酰胺正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以溫度、時(shí)間和鹽酸濃度作為因素變量，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及脫酰胺度Table 2 Orthogonal test design and the deamidizationdegrees

由表2極差分析可知，影響鴨蛋蛋清蛋白脫酰胺的因素主次排序?yàn)椋簻囟?鹽酸濃度>時(shí)間，其中最佳方案為A3B3C3，即脫酰胺溫度95 ℃，時(shí)間6 h，鹽酸濃度0.5 mol/L。在此條件下進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明產(chǎn)物的脫酰胺度為73.77%，鑒于該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與A3B1C3的結(jié)果(72.67%)基本相當(dāng)，且由方差分析結(jié)果(表3)可知，反應(yīng)時(shí)間對脫酰胺度無顯著性影響，而溫度和鹽酸濃度對脫酰胺度影響顯著(P<0.05)，故從節(jié)省能源、時(shí)間和成本考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用A3B1C3的實(shí)驗(yàn)條件，即脫酰胺溫度95 ℃，時(shí)間4 h，鹽酸濃度0.5 mol/L對蛋清蛋白進(jìn)行脫酰胺處理。

正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果如表3所示：

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19.00；F0.01(2,2)=99.00

2.3 高攜鈣能力鴨蛋蛋清肽制備用酶篩選實(shí)驗(yàn)

以脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白為底物，以可溶性鈣結(jié)合量和水解度作為測定指標(biāo)，對促鈣吸收鴨蛋蛋清肽制備用酶進(jìn)行篩選，在五種蛋白酶的最適溫度、pH(廠家推薦)以及料液比3%、酶解時(shí)間3 h、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的反應(yīng)條件下，比較其酶解效果。由表4可知，就水解度而言，經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理后，水解度達(dá)11.91%，顯著高于其他四種蛋白酶酶解物(P<0.05)，而中性蛋白酶和胰蛋白酶的水解度僅有3.95%和3.88%。就可溶性鈣結(jié)合量而言，經(jīng)過木瓜蛋白酶處理的脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白水解物其可溶性鈣結(jié)合量達(dá)8.68 mgCa/g肽，顯著高于其他四種蛋白酶酶解物(P<0.05)；而水解度較高的堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的可溶性鈣結(jié)合量均較低，僅為2.06%和3.56%，這說明蛋白水解物的促鈣吸收活性與水解度并非呈正相關(guān)的關(guān)系。本研究以制備高攜鈣能力蛋清肽為主要目的，以可溶性鈣結(jié)合量作為考慮的主要指標(biāo)，綜合考慮最終選木瓜蛋白酶為本實(shí)驗(yàn)用酶。

表4 五種蛋白酶酶解效果的比較Table 4 Comparison of the duck egg white hydrolyzed bydifferent proteases

注：組內(nèi)相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.4 酶解單因素試驗(yàn)

2.4.1 酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白的影響

在木瓜蛋白酶最適溫度50 ℃、最適pH 6.5以及料液比3%、酶解時(shí)間為3 h時(shí)，考察酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白酶解效果的影響，結(jié)果如圖4所示，隨著酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，水解度不斷增大；而可溶性鈣結(jié)合量先增大，在酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)達(dá)到最大，之后又逐漸降低。這可能是由于酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，使適合螯合鈣離子的肽段進(jìn)一步水解，故可溶性鈣結(jié)合量呈下降趨勢。因此，酶解條件宜選酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。

圖4 酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解脫酰胺蛋清蛋白的影響
Fig.4 Effects of quality fraction of enzyme on the enzymo-
lysis of the deamidization duck egg white

2.4.2 料液比對酶解脫酰胺蛋清蛋白的影響

當(dāng)pH為6.5、酶解溫度為50 ℃、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%、酶解時(shí)間為3 h時(shí)，考察料液比對脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白酶解效果的影響，結(jié)果如圖5所示，隨著料液比的增加，水解度先快速增加，后緩慢增加；可溶性鈣結(jié)合量先增大，在料液比為4%時(shí)達(dá)到最大，之后又迅速降低。由圖5可知，水解度與可溶性鈣結(jié)合量并非呈完全的正相關(guān)關(guān)系。因此，料液比選4%為宜。

圖5 料液比對酶解脫酰胺蛋清蛋白的影響
Fig.5 Effects of substrate concentration on the enzymolysis
of the deamidization duck egg white

2.4.3 酶解時(shí)間對酶解脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白的影響

當(dāng)pH為6.5、溫度為50 ℃、料液比為3%、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，考察酶解時(shí)間對脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白酶解效果的影響，結(jié)果如圖6所示，隨著酶解時(shí)間的增加，水解度先增加，在3 h后基本不變；而可溶性鈣結(jié)合量先增大，在3 h時(shí)達(dá)到最大，之后逐漸下降。其原因可能為隨著酶解時(shí)間的增加，底物蛋白中先不斷釋出高鈣結(jié)合能力的肽段，使得可溶性鈣結(jié)合量增加。繼續(xù)酶解又將合適的肽段降解，導(dǎo)致可溶性鈣結(jié)合量反而降低，因此，酶解時(shí)間選3 h為宜。

圖6 酶解時(shí)間對酶解脫酰胺蛋清蛋白的影響
Fig.6 Effects of hydrolysis time on the enzymolysis of the
deamidization duck egg white

2.5 酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

在酶解單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比和酶解時(shí)間作為因素變量，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 酶解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 5 Enzymolysis orthogonal test design

由表5極差分析結(jié)果可知，就水解度而言，影響其大小的因素依次為A>C>B，最佳工藝為A3B2C1；影響可溶性鈣結(jié)合量大小的因素依次為A>B>C，最佳酶解工藝為A2B2C3。由方差分析結(jié)果(表6)可知，就水解度而言，時(shí)間和料液比的影響均不顯著，而酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解度的影響顯著(P<0.05)；對可溶性鈣結(jié)合量而言，酶解時(shí)間和料液比對酶解效果的影響均顯著(P<0.05)，而酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對可溶性鈣結(jié)合量有極顯著影響(P<0.01)。綜上，制備高攜鈣能力鴨蛋蛋清肽的最佳酶解條件為A2B2C3，即脫酰胺蛋清蛋白酶解溫度50 ℃、pH 6.5、料液比5%、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、酶解時(shí)間3 h。在此條件下，得到的脫酰胺鴨蛋蛋清肽攜鈣能力最強(qiáng)，此時(shí)水解度為5.35%，可溶性鈣結(jié)合量為14.42 mgCa/g肽。

正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果見表6。

表6 酶解正交試驗(yàn)方差分析表Table 6 Variance analysis of enzymolysis orthogonal test

注：F0.05(2,2)=19.00；F0.01(2,2)=99.00

2.6 不同級分脫酰胺蛋清肽結(jié)合鈣能力比較

由圖7可知，與未分級的脫酰胺蛋清肽比較，分子質(zhì)量<3 k和<1 k的級分，其鈣結(jié)合能力均增強(qiáng)，且分子質(zhì)量較小的級分(分子質(zhì)量<1 kDa)其鈣結(jié)合能力更高，可溶性鈣結(jié)合量達(dá)14.93 mgCa/g肽；而高分子質(zhì)量級分(分子質(zhì)量>6 kDa、5～6 kDa)的可溶性鈣結(jié)合量均顯著低于未經(jīng)分級肽。該結(jié)果提示，短鏈肽更易與Ca2+結(jié)合，這可能是由于短鏈肽的空間位阻較小，且與鈣的配位基團(tuán)增多，從而導(dǎo)致其具有較高的攜鈣能力。

圖7 不同級份脫酰胺蛋清肽可溶性鈣結(jié)合量比較
Fig.7 Calcium-binding ability of different ultrafiltration
fractions from deamidization DPs
注：組內(nèi)相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，
不同字母代表差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

通過鹽酸對鴨蛋蛋清蛋白脫酰胺單因素以及正交試驗(yàn)，確定了鹽酸法脫酰胺的最適條件為：溫度95 ℃，反應(yīng)時(shí)間4 h，鹽酸濃度0.5 mol/L，在此條件下制備出的脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白的脫酰胺度高達(dá)72.67%。

經(jīng)篩選后從5種蛋白酶中選出木瓜蛋白酶為本實(shí)驗(yàn)用酶，通過單因素以及正交試驗(yàn)，確定了脫酰胺鴨蛋蛋清蛋白的酶解條件為：溫度50 ℃、pH 6.5、料液比5%、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、酶解時(shí)間3 h。在此條件下，得到的脫酰胺鴨蛋蛋清肽水解度為5.35%，可溶性鈣結(jié)合量為14.42 mgCa/g肽。經(jīng)過超濾分級后，發(fā)現(xiàn)分子量小的級分其鈣結(jié)合能力更強(qiáng)。

在前期進(jìn)行蛋白質(zhì)脫酰胺的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們分別采用有機(jī)酸(檸檬酸)、鹽酸以及酶法(谷氨酰胺酶)3種方法進(jìn)行脫酰胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸法、檸檬酸法的脫酰胺度高于酶法，且鹽酸法得率高于檸檬酸法，并且其成本較低，故本實(shí)驗(yàn)的脫酰胺方法選擇了鹽酸法。與趙寧寧用酶法對鴨蛋蛋清肽進(jìn)行脫酰胺所得產(chǎn)物的鈣結(jié)合能力(7.51 mgCa/g肽)相比，經(jīng)鹽酸法脫酰胺的鴨蛋蛋清蛋白再酶解制肽，其可溶性鈣結(jié)合能力又有顯著提高。廉雯蕾等[18]曾采用鹽酸法對米蛋白先進(jìn)行脫酰胺再酶解所得產(chǎn)物具有較高亞鐵螯合能力，這是其螯合能力提高的佐證。分析其可能的原因是：鹽酸法脫酰胺與酶法脫酰胺相比，反應(yīng)條件更加劇烈，能夠獲得更高的脫酰胺度，即能產(chǎn)生更多的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)——羧基；另外，先將蛋白酶解成肽，再進(jìn)行脫酰胺處理時(shí)，會使某些溶解性不夠高的未被酶解的蛋白在離心過程中被沉淀除去，從而導(dǎo)致脫酰胺作用靶點(diǎn)減少；而本實(shí)驗(yàn)對蛋白先進(jìn)行脫酰胺再酶解制肽，使其脫酰胺位點(diǎn)增多，且蛋白質(zhì)在脫酰胺的過程中，鹽酸也會使部分蛋白鏈上發(fā)生斷鍵，使蛋白質(zhì)鏈變短，更利于后期酶解反應(yīng)的進(jìn)行。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所采用的先對蛋白質(zhì)進(jìn)行脫酰胺處理，再進(jìn)行酶解的方法可使鴨蛋蛋清肽的可溶性鈣結(jié)合量大幅提高(P<0.05)，為今后提高蛋白水解物——肽的攜鈣能力拓展了新的方法。