干預細胞死亡在腎臟病治療中的研究進展

湯 雄，張 炯綜述，王金泉審校

作者單位：210002南京，南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院）國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心全軍腎臟病研究所[湯 雄（醫(yī)學碩士研究生）、張 炯、王金泉]

0 引 言

腎病通常按起病方式和臨床轉(zhuǎn)歸可分為慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）和急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。AKI和CKD既互相有區(qū)別，又互相聯(lián)系，一方面CKD是AKI發(fā)生的高危因素，另一方面AKI也可進展至 CKD［1］。2004年美國公共衛(wèi)生調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，成年人中CKD的發(fā)病率約為14%［2］，對中國人群的大型流行病調(diào)查表明中國成人CKD發(fā)病率為10.8%［3］，隨著人口老齡化及社會環(huán)境的變遷中國成人CKD發(fā)病率有可能進一步上升。而AKI作為患者死亡風險的高危因素，一項針對四大洲AKI事件的Meta分析指出，心臟手術、重癥監(jiān)護、創(chuàng)傷及社區(qū)獲得的成人AKI綜合死亡率23.9%，兒童為13.8%［4］。然而目前的臨床用藥難以涵蓋不同病因、不同病理改變的CKD及AKI，難以逆轉(zhuǎn)CKD的進展及在此基礎上AKI的發(fā)生。最近，對一些腎疾病動物模型的研究結果發(fā)現(xiàn)，細胞死亡在疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，學界提出針對細胞死亡與生存調(diào)控異常的潛在靶點。本文主要對近年來在細胞死亡與生存異常調(diào)控方面的研究進展以及干預細胞死亡與生存異常調(diào)控在CKD和AKI病理生理過程中可能發(fā)揮的療效作一綜述。

1 腎病中的細胞死亡通路

1.1 外源性和內(nèi)源性凋亡通路 細胞凋亡是一個受到嚴密調(diào)控的細胞程序性死亡過程，其中半胱天冬酶依賴的細胞凋亡可由內(nèi)源性或外源性因素刺激啟動［5］。內(nèi)源性因素包括細胞應激、發(fā)育信號以及生長因子下調(diào)等，這些刺激可導致包括線粒體損傷在內(nèi)的細胞完整性受到破壞。Bcl-2家族蛋白在內(nèi)源性細胞凋亡線粒體通路調(diào)節(jié)中起關鍵作用，其中促凋亡因子（如Bim或Bid）和效應因子（如Bak和Bax）能抵消抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1的抑制作用。當平衡被打破傾向于凋亡時，Bcl-2會釋放細胞色素C，形成凋亡復合體1（Apaf-1），并活化半胱天冬酶-9（caspase-9）。活化的caspase-9隨后激活caspase-3和 caspase-7，從而導致細胞死亡［6］。目前多借助于Bax-或Bak-缺陷小鼠來觀察線粒體凋亡通路在腎臟損傷中的作用。在缺血性急性腎損傷的小鼠模型中，敲除Bax或Bak基因能抑制腎小管上皮細胞凋亡，對腎起部分保護作用［7］。

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族的死亡配體與細胞表面含死亡結構域的TNF受體（TNFR）結合啟動外源性細胞凋亡通路，并募集各類因子形成受體相關的死亡誘導信號復合物。死亡受體4和5（death receptor，DR4、DR5）以及Fas共同募集配體蛋白Fas相關死亡結構域（fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD），與受體相互作用蛋白1（receptor interaction protein，RIP1）結合，進而引起caspase-8激活及其下游效應因子caspase-3和caspase-7活化［8］。TNFR1和DR3在其受體復合物中結合其他蛋白質(zhì)分子，包括TNFR相關死亡結構域、RIP1、TNFR相關因子2和細胞凋亡抑制劑（c-IAP1、c-IAP2）。c-IAP1和c-IAP2通過各種連鎖反應使受體相互作用蛋白1泛素化，TNFR1受體相關復合體中K63-和K11-連接的多聚泛素鏈是其中最重要的一條［9］。研究證實通過去泛素化酶A20去除RIP1中的c-IAP蛋白或泛素化基團可形成完整的具有功能的復合體Ⅱ，繼而活化caspase-8并導致細胞凋亡［10］。抑制性caspase-8樣分子FLICE-抑制蛋白也可阻斷這條通路，通過與caspase-8競爭性結合FADD，并募集凋亡受體復合物來抑制凋亡受體-凋亡途徑的活化［11］。外源性和內(nèi)源性凋亡通路最終都是由活化效應因子caspase-3和caspase-7，從而介導細胞凋亡［12］。

盡管TNF配體和TNFR受體超家族極大地影響腎損傷時的細胞存活和炎癥反應，但單個配體或受體的功能并不完全清楚，且與其他凋亡配體和受體相比，F(xiàn)as在缺血性急性腎損傷細胞凋亡和炎癥反應中可能發(fā)揮更大的作用［13］。目前腎病理學研究中的最引人關注的TNF家族成員為TNF相關配體TNF樣弱凋亡誘導因子（TNF-like weak inducer of ap-optosis，TWEAK）。TWEAK通過經(jīng)典或非經(jīng)典核因子-κB以及絲裂原活化的蛋白激酶信號通路，促進細胞凋亡和炎癥反應［14］?？筎WEAK抗體作為一種組織細胞保護策略在狼瘡性腎炎中的療效正處于臨床試驗階段［15］。

1.2 調(diào)節(jié)性細胞壞死 半胱天冬酶活性受到抑制能夠中止TNFR1介導的細胞凋亡信號通路，在這種情況下，細胞可進入另一條死亡途徑——壞死性凋亡。壞死性凋亡是由TNF信號啟動的可調(diào)節(jié)性細胞壞死，受RIP1和RIP3激酶調(diào)節(jié)［16］。除TNF，病原體識別受體、Toll樣受體、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體以及RNA解旋酶也可誘導壞死性凋亡。一旦調(diào)亡誘導信號復合體形成，RIP1和RIP3就會發(fā)生一系列自磷酸化和交叉磷酸化反應，磷酸化的RIP3可結合并磷酸化混合系蛋白激酶樣結構域（mixed lineage kinase domain-like，MLKL），這是誘導壞死性細胞凋亡的最關鍵步驟，MLKL的磷酸化能觸發(fā)自身寡聚化并向質(zhì)膜易位從而促進壞死性細胞凋亡［17］。RIP1激酶抑制劑（necrostatin-1）或RIP3激酶抑制劑可導致激酶失活，從而阻斷壞死性凋亡［18］。

借助于necrostatin-1和RIP3的基因敲除已經(jīng)證實壞死性凋亡部分參與了腎損傷過程。necrostatin-1能有效減輕小鼠急性腎損傷以及降低血尿素氮和肌酐水平，RIP3缺陷小鼠同樣也能有效減輕腎缺血-再灌注急性腎損傷［17］。對小鼠腎移植模型研究表明，與對照組相比，接受來自RIP3基因敲除（供體）的移植腎小鼠存活期更長，移植腎功能更好，從而表明供腎中RIP3介導的壞死性凋亡以及其他死亡信號通路活化能夠促進炎性腎損傷［19］。因而，有理由相信針對RIP1和（或）RIP3的靶向治療，是減輕缺血-再灌注腎損傷和提高移植腎存活率的一種潛在治療策略。

1.3 其他類型死亡通路 與壞死性凋亡不同，細胞焦亡是一種程序性細胞死亡過程，當組織出現(xiàn)炎癥反應時，caspase-1和caspase-11（小鼠）或caspase-4和caspase-5（人），可引起細胞迅速腫脹和溶解，最終導致細胞內(nèi)炎性復合體的釋放，進一步導致炎癥反應擴散［20］。最近的遺傳學研究表明，caspase-11作為細胞焦亡的關鍵，能夠引發(fā)細胞的死亡，而caspase-1則介導IL-1β和IL-18的分泌，促進炎癥擴散。Caspase-1和caspase-11能夠裂解gasdermin D（gsdmD），使后者N端和C端的結構域分開，N端片段可識別并結合細胞膜的磷脂類分子，在細胞膜上形成孔隙，導致細胞滲透壓的變化，出現(xiàn)細胞裂解、焦亡［21］。Zhan等［22］對小鼠腎缺血-再灌注損傷的研究顯示，損傷后腎組織中caspase-1，caspase-11和IL-1β的表達增加，提示腎缺血-再灌注損傷中可能存在細胞焦亡。對選擇性caspase-11抑制劑和caspase-1/11雙敲除小鼠的進一步研究，將有助于更全面的認識細胞焦亡對腎缺血-再灌注損傷的作用。

線粒體與固有的細胞凋亡通路相關［11］；此外，由離子、核苷酸、活性氧自由基和其他因素激活的線粒體膜通透性改變（mitochondrial permeability transition，MPT）也可導致壞死性細胞死亡。線粒體跨膜通道的開放稱為MPT，受親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，CYPD）的調(diào)節(jié)，CYPD為可被免疫抑制劑環(huán)孢菌素A或薩菲菌素A抑制的蛋白質(zhì)［23］。對CypD基因敲除小鼠腎損傷的研究，結果發(fā)現(xiàn)CypD基因敲除可減少壞死性凋亡，進而減輕小鼠IRI腎損傷，提示小鼠IRI腎損傷可能存在MPT［24］。更有意義的是，在IRI模型中，CypD和RIP3基因的雙敲除可較任一單一基因敲除有更大的獲益。RIP1抑制劑-1和MPT抑制劑薩菲菌素A的聯(lián)合應用也證實了上述研究結論，表明腎缺血-再灌注損傷中可能同時存在的兩種獨立的調(diào)節(jié)性壞死途徑［25］。

依賴于鐵和谷胱甘肽代謝的調(diào)節(jié)性細胞壞死，稱之為鐵凋亡（ferroptosis），是另一種細胞死亡方式。鐵凋亡引起ROS的積聚，并能夠被ferrostatin-1抑制。Ferrostatin-1能有效阻斷IRI引起的腎小管損傷，并降低血清尿素氮和肌酐水平。此外，ferrostatin-1能阻止腎近端腎小管上皮細胞死亡，同時減少氧化損傷后ROS的產(chǎn)生［26］?；趂errostatin-1上述腎保護作用，鐵凋亡可能是缺血-再灌注腎損傷機制之一，可作為缺血-再灌注腎損傷的潛在治療靶點。

由紫外線、ROS或烷基化劑誘導的DNA損傷能激活多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP1），有助于損傷的修復。但PARP1過度活化可引起parthanatos——PARP1依賴的細胞死亡［27］。對單側輸尿管結扎小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，PARP1敲除小鼠腎間質(zhì)纖維化明顯減輕，炎性因子前體表達明顯減弱，表明PARP1在梗阻性腎損傷中介導了壞死性細胞死亡，主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化與促進炎性信號傳導［28］。同樣，PARP1缺乏能減少順鉑誘導的腎功能損傷，氧化應激、促炎性因子誘導的腎小管壞死［29］。上述研究表明PARP1可能是梗阻性腎損傷和其他腎毒性腎損傷的潛在治療靶點。

其他形式的細胞死亡，如失巢凋亡和自噬性細胞死亡，與腎病的聯(lián)系并不明確。越來越多的證據(jù)顯示，大多數(shù)腎病理損害不能歸因于與某一種單一的細胞死亡通路。大多數(shù)情況下，腎損傷時會有兩個或兩個以上的細胞死亡通路激活，致使對疾病過程和致病機制的理解難度增加，同時也不利于發(fā)現(xiàn)最有效的治療方法。最典型的是足細胞，作為一種高度分化的上皮細胞，在足細胞中幾乎能觀察到所有的細胞死亡通路［30］。盡管存在諸多困難，良好的實驗動物模型，借助于基因敲除和特異性化學抑制劑，可以最大程度地理解各種細胞死亡途徑在特定腎病理過程的意義。

2 干預AKI細胞死亡通路

按病變部位AKI可分為腎前性，腎性及腎后性，按病理改變也可分為急性間質(zhì)性腎炎及急性腎小管壞死，病因又能夠分為腎毒性藥物性、腎缺血等，鑒于AKI發(fā)生的病因、病理多樣性，AKI最為有效的治療應該是對高?；颊叩念A防。盡管目前尚無針對性的臨床藥物，缺乏臨床試驗，一些研究也顯示靶向干預細胞死亡通路活化藥物療效有限，并不能減輕、消除類似缺血-再灌注損傷導致的細胞死亡和/或腎損害［31-33］。但干預細胞死亡預防和治療AKI存在扎實的理論基礎，如移植腎功能延遲恢復最常見原因是缺血-再灌注損傷，可導致細胞凋亡通路的激活從而對移植腎帶來不良后果。對AKI過程中細胞死亡通路更深入的認識及更加精準的靶藥物治療，將為AKI的治療提供新的思路及治療策略。

3 干預腎病相關細胞死亡通路

根據(jù)腎病理生理學特性，針對細胞死亡通路的治療著重于阻止細胞死亡的發(fā)生，同時抑制細胞死亡相關因子的釋放，從而阻斷這些因子促進炎癥的發(fā)生發(fā)展。既往研究顯示在RIP1和RIP3激酶介導的調(diào)節(jié)性壞死過程中，RIP3起主導作用。但最近的研究表明，RIP3激酶基因敲除或化學抑制可以誘導細胞凋亡，最終導致突變動物死亡［17］。MLKL作為另一種壞死性調(diào)節(jié)因子，與RIP1和RIP3不同，MLKL不具有可識別酶活性，因此很難成為藥物干預靶點［18］。不排除未來會發(fā)現(xiàn)一些小分子化合物，可選擇性阻斷壞死性凋亡細胞信號誘導的MLKL構象變化，并將MLKL易位到胞膜中，從而阻止壞死性細胞死亡。

RIP1作為上述通路中的第三種壞死性調(diào)節(jié)因子，是一種通路頂端激酶，可調(diào)控大多數(shù)的壞死性凋亡的應答。與RIP3不同，RIP1激酶功能突變并不會對細胞或動物有任何不利的影響。迄今發(fā)現(xiàn)的小分子RIP1激酶抑制劑具有極高的選擇性，在動物模型中證實安全性好［32］。RIP1激酶抑制劑同樣具有較高安全性，RIP1激酶在壞死性凋亡炎癥通路中具有重要的功能，這些特征使RIP1為一個幾乎完美的治療靶點。已有藥企將RIP1作為小分子激酶抑制劑的靶目標，進一步將開展臨床研究以證實以RIP1激酶活性為干預目標在腎臟病理學改變上是否有效果。

除細胞凋亡和壞死性凋亡，細胞焦亡、parthanatos、MPT介導的細胞死亡和鐵凋亡等也在腎病發(fā)生發(fā)展中起作用。雖然細胞焦亡的確切作用有待臨床驗證，但在動物模型中已經(jīng)獲得了令人振奮的研究結果，將CYPD、PARP1或鐵凋亡等通路作為目標可能成為干預腎病的新策略。目前優(yōu)化鐵凋亡抑制劑ferrostatin-1，以驗證其逆轉(zhuǎn)缺血-再灌注腎損傷中的氧化應激相關損害的研究正在進行中。以CYPD和MPT介導的細胞死亡為靶點的藥物已經(jīng)用于治療炎癥性疾病及預防器官移植排斥反應。有理由相信未來也可以通過環(huán)孢素A或薩菲菌素A來治療多種腎病，包括腎病綜合征和急性腎損傷。

4 結 語

綜上所述，干預細胞死亡通路作為腎病治療的新策略，進一步建立可靠的動物模型、臨床前研究及良好設計的臨床實驗將會顯示以干預細胞死亡通路為目標的確切療效。如同大多數(shù)癌癥患者接受多種抗癌藥物的聯(lián)合治療一樣，腎病患者也能從多種細胞死亡抑制劑聯(lián)合使用中獲益。同時，尋找發(fā)現(xiàn)確切的具有診斷性及預后判斷性生物標記物至關重要。在急慢性腎損傷致病機制、動物模型和臨床研究中仍需付出更多的努力，以發(fā)現(xiàn)能夠直達病灶、直擊致病機制靶點的真正有效的藥物，給予腎病患者帶來新的曙光。