蛙溫和氣單胞菌分離株的藥敏試驗

曾彥欽 林秋娟 潘 平 陳 震 林福忠 蔡鶴鳴 福州市農(nóng)業(yè)科學研究所 福州 350008

美國青蛙（Rana grylio），俗稱牛蛙。蛙溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）是牛蛙紅腿病的主要病原菌。臨床上，患蛙表現(xiàn)腹部外觀呈淺紅色，肝臟充血、出血斑點，腎充血、出血，大量腹水等特征。該病多發(fā)生在蝌蚪發(fā)育成幼蛙后的2～3周內(nèi)。發(fā)病率可達70%～80%，病死率可達50%～60%，該病發(fā)病急，病程短，給蛙場造成很大損失。筆者從漳州3個蛙場分離出18株蛙溫和氣單胞菌菌株，并對其進行18種抗生素敏感性試驗，現(xiàn)將詳情報道如下。

1.1.2 細菌生化試驗 結果為：（1）37℃能生長、接觸酶試驗陽性、V-P試驗陽性、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、靛基質(zhì)試驗陽性、甘油試驗陽性、硝酸鹽還原試驗陽性、半固體培養(yǎng)基刷狀或絮狀生長、半乳糖產(chǎn)酸、蔗糖產(chǎn)酸、麥芽糖產(chǎn)酸、甘露醇產(chǎn)酸、海藻糖產(chǎn)酸、水解淀粉，明膠試驗6℃液化、甲基紅試驗陽性、脫脂奶溶解試驗陽性；（2）硫化氫試驗陰性、尿素酶試驗陰性、阿拉伯糖發(fā)酵陰性、七葉苷發(fā)酵陰性、水楊苷發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性；（3）賴氨酸脫羧酶試驗陽性、鳥氨酸脫羧酶試驗陽性、精氨酸雙水解酶試驗陽性或陰性、果糖產(chǎn)酸陽性或陰性。

選其中4株蛙溫和氣單胞菌（V-P試驗陽性-紅色最深、脫脂奶溶解試驗陽性-溶解環(huán)最寬、果糖產(chǎn)酸-粉紅色最深），以其24 h肉湯培養(yǎng)物0.2 mL，頸部皮下注入健康小白鼠（體重15～21 g，每組3只，共15只）。試驗小白鼠注射菌液后的第9 h陸續(xù)發(fā)病，安靜、食欲下降、寒戰(zhàn)、喘息、耳部變蒼白，發(fā)病后36～72 h陸續(xù)死亡。剖檢，見注射局部有大量膿血水，肝腎充血腫大、有出血斑點，肺充血，淺紅色腹水。取病死小白鼠心血接種RS培養(yǎng)基，分離出溫和氣單胞菌菌株。對照組連續(xù)飼養(yǎng)觀察10 d，小白鼠均存活。

1 材 料

1.1 蛙溫和氣單胞菌菌株 無菌操作取患蛙肝、腎組織，接種RS培養(yǎng)基平皿，30℃培養(yǎng)24 h；選光滑圓整、半透明、微隆起、淺桔黃色、直徑0.8～1.2 mm的菌落，以氧化酶試紙檢測所選菌落；挑氧化酶試驗陽性菌落，穿刺AHM試管斜面；選AHM試管斜面呈上層紅色、下層黃色、毛絮狀生長、有氣泡、無黑色物的培養(yǎng)物，進行革蘭氏染色鏡檢和細菌生化鑒定。

1.1.1 鏡檢 12.5×100倍油鏡下呈革蘭氏陰性短小桿菌。

1.2 藥敏紙 由Oxoid ltd.Basingstoke(Hampshire Englang)生產(chǎn)，批號2018-03。

1.3 培養(yǎng)基、試劑 AHM培養(yǎng)基、RS培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、脫脂奶蔗糖營養(yǎng)瓊脂、各種細菌生化鑒定管和鑒定試劑，由青島海博生物技術有限公司生產(chǎn)。

1.4 試驗動物 小白鼠由福建省疾病預防控制中心醫(yī)學實驗動物研究所提供。

2 方 法

先將18株蛙溫和氣單胞菌菌株分別接種于AHM試管斜面，培養(yǎng)24 h。分別以接種環(huán)釣取各株菌落混于無菌生理鹽水中，再以無菌棉簽蘸取菌液，均勻涂抹于普通營養(yǎng)瓊脂平板（每菌株需4個平板），涂滿不留空隙。再以鑷子夾取藥敏紙片貼在待測菌的瓊脂平板上，并用鑷子輕壓紙片。注意無菌操作和編號。培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

3 結 果

測量抑菌圈直徑平均值，結果：慶大霉素（20.4 mm）、氟苯尼考（19.2 mm）為相對高效藥物；中效藥物從高到低依次為阿米卡星（18.1 mm）、蒽諾沙星 （17.5 mm）、新 霉 素 （17.5 mm）、氧 氟 沙 星（16.4 mm）、 環(huán) 丙 沙 星 （14.1 mm）、 諾 氟 沙 星（13.4 mm）；低效藥物有紅霉素（11.8 mm）、強力霉素（11.5 mm）、多粘菌素 （8.6 mm）。復方新諾明（0 mm）、四環(huán)素（4 mm）、阿莫西林（0 mm）、氨卞西林（0 mm）、頭孢噻吩（2.8 mm）、桿菌肽（0 mm）、鏈霉素（0 mm）為無效藥物。

4 討論與小結

1）參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》第二版中的氣單胞菌屬（Aeromonas）內(nèi)容和GB/T 18652-2002《致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法》，對分離菌進行鑒定，確定分離菌為溫和氣單胞菌[1]。

2）仔細分析表1結果發(fā)現(xiàn)，從同一牛蛙場分離出的溫和氣單胞菌不同菌株，其藥敏試驗結果存在較大的差異。例如，來源于A蛙場的蛙5-2株和胃3株，前者對慶大霉素和紅霉素敏感，后者卻無效；來源于B蛙場的B2-2株對喹諾酮類藥不敏感，但對紅霉素敏感，B3-2株卻相反；來源于C蛙場的Q1-22株和Q3-21株，也不同于C場的其他溫和氣單胞菌株。

試驗結果表明，蛙溫和氣單胞菌對抗生素的耐藥性是嚴重的，說明該地區(qū)或很可能不僅限于該地區(qū)，牛蛙場濫用抗生素的現(xiàn)象比較普遍。由于溫和氣單胞菌也能致其他水產(chǎn)生物發(fā)病，這些耐藥性菌株也可能來源于其他水產(chǎn)生物養(yǎng)殖場。

3）牛蛙養(yǎng)殖密度很高，一定要有充足的潔凈水源（最好是深井水或水庫源頭水），不可用別的水產(chǎn)生物養(yǎng)殖場廢棄水。蛙溫和氣單胞菌病的防疫應從水源、引種、隔離入手，該抗生素敏感性試驗結果可作為該地區(qū)牛蛙場參考；結合牛蛙場的養(yǎng)殖特點，需選用易溶于水的藥物混合飼料；用藥時須注意無公害的問題。

表1 18種抗生素對18株蛙溫和氣單胞菌菌株的抑菌圈直徑