PCV2b Cap蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建及鑒定

劉喜鳳 黃丹丹 張學(xué)賢

（1.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司動物醫(yī)學(xué)研究中心 北京 102609；2.北京市畜禽生物制品工程技術(shù)研究中心 北京 102609）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的一種動物病毒[1]，純化后的PCV樣品，電鏡觀察為17 nm無囊膜的球狀病毒粒子。PCV基因組為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，基因組非常小，PCV有2種血清型，PCV1和PCV2，兩種血清型毒株之間的序列同源性低于80%[2]。PCV2毒株可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d[3]，2003年之前，PCV2a為臨床感染的豬群中最為流行的基因型，2003年之后則以PCV2b為主。PCV1基因組全長為1 559 bp，PCV2全長為1 767 bp或1 768 bp，主要編碼3個蛋白，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)復(fù)制蛋白Rep，大小為314個氨基酸，ORF2編碼病毒核衣殼蛋白Cap，是唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，大小為233～234個氨基酸，是主要的免疫原性蛋白，可以自我組裝成病毒粒子，ORF3與ORF1重疊，編碼大小為105個氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白。PCV1無致病性，PCV2感染可引起幾種綜合征和疾病，包括斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、繁殖障礙、豬呼吸綜合征等，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失[4]。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Baculovirus expression system，BEVS）是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，能有效進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后加工，表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性與天然蛋白十分接近，特別適合于真核蛋白的制備研究，已成功表達(dá)了多種功能蛋白[5]。

本試驗(yàn)按照昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化合成PCV2b ORF2編碼的Cap蛋白基因序列，通過分子克隆的方法將該序列連接到改造過的桿狀病毒載體PMP10-Fastdual中，構(gòu)建表達(dá)PCV2b Cap蛋白的重組桿狀病毒載體PM-P10-Fastdual-2b，通過桿粒制備、sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染，篩選到表達(dá)PCV2b Cap蛋白的重組桿狀病毒株，IFA、SDS-PAGE及Western-blotting結(jié)果都表明，PCV2b Cap蛋白獲得成功表達(dá)，為開發(fā)豬圓環(huán)PCV2b亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 PM-P10-Fastdual質(zhì)粒、DH10Bac感受態(tài)和sf9細(xì)胞為大北農(nóng)（大興）科技園保存；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，高保真DNA聚合酶購自Takara公司。DNAMarker Trans2K○RPlus II DNA Marker和蛋白Marker Blue Plus II Protein Marker（14-120 kDa）購買自北京全式金生物技術(shù)有限公司，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（Sf-900TMIII SFM/Grace's Medium）購自Thermo公司，F(xiàn)uGENE6 Transfection購自Promega公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)流程 試驗(yàn)按圖1流程進(jìn)行。

1.2.2 序列合成 根據(jù)GenBank公布的PCV2 Cap蛋白序列（ACN59889），按照昆蟲細(xì)胞密碼子偏愛性對2b-Cap基因進(jìn)行優(yōu)化和合成，通過酶切連接的方法將該基因連接到實(shí)驗(yàn)室保存的昆蟲細(xì)胞高表達(dá)載體PM-P10-Fastdual中，構(gòu)建高表達(dá)PCV2b Cap蛋白的昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體PM-P10-Fastdual-2b。

1.2.3 PM-P10-Fastdual-2b質(zhì)粒構(gòu)建和驗(yàn)證 將合成的720 bp 2b-Cap基因序列（兩端帶有XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)）以及PM-P10-Fastdual載體XhoⅠ和KpnⅠ雙切，回收2b-Cap和PM-P10-Fastdual雙切片段，連接構(gòu)建PM-P10-Fastdual-2b表達(dá)載體，大小為8 715 bp，該載體圖譜見圖2。試驗(yàn)通過測序及設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增2b-Cap序列，通過XhoⅠ和KpnⅠ雙切PM-P10-Fastdual-2b來驗(yàn)證該質(zhì)粒是否構(gòu)建正確。

圖2 PM-P10-Fastdual-2b質(zhì)粒圖譜

圖1 試驗(yàn)流程圖

1.2.4 重組rBacmid-2b構(gòu)建和鑒定 按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression Syste表達(dá)系統(tǒng)操作說明，將驗(yàn)證正確的重組桿狀病毒質(zhì)粒PM-P10-Fastdual-2b轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，如圖3所示，在DH10Bac細(xì)胞中，重組轉(zhuǎn)移載體PM-P10-Fastdual-2b與Bacmid發(fā)生位點(diǎn)特異性的轉(zhuǎn)座作用，經(jīng)藍(lán)白菌落篩選及利用通用引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得含2b-Cap基因序列的重組病毒桿粒rBacmid-2b。前取混懸液、離心后取上清、細(xì)胞重懸液制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳封閉過夜，加入1：100稀釋的豬圓環(huán)病毒陽性血清，室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，加入1：5 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG，室溫孵育1 h，洗滌3次后，加入化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果和討論

2.1 PM-P10-Fastdual-2b質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 按照

圖3 Bacmid位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座示意圖

1.2.5 重組桿狀病毒的獲得與病毒擴(kuò)增 按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的說明操作，將重組穿梭載體rBacmid-2b轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞，27℃靜置培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后72 h收毒，500 g離心5 min，移取上清于干凈的EP管中，4℃避光保存，即P1病毒RAC-2bCap。將P1代RAC-2bCap按1：10的體積比感染處于對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)2～3 d至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時，凍融2次，500 g離心5 min，去除細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片，收集上清4℃避光保存，即為第2代病毒，P1代RAC-2bCap，用同樣的方法獲得第3代病毒，P3代RAC-2bCap毒。

1.2.6 間接免疫熒光（IFA）鑒定2b-Cap蛋白表達(dá)六孔板接毒，72 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS洗板3次，每次洗5 min；80%丙酮固定液加入孔中，每孔2 mL，4℃固定30 min；PBS洗板3次，每次洗5 min；PCV2陽性豬血清用PBS按1∶200稀釋，37℃孵育1 h；PBS洗板3次，每次洗5 min；FITC-山羊抗豬IgG用PBS按1∶100稀釋，37℃避光孵育1 h；PBS洗板3次，每次洗5 min；熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 SDS-PAGE及Western-blotting鑒定2b-Cap蛋白表達(dá) 將P3代RAC-2bCap重組桿狀病毒按1：50體積比接種對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞，分別于24 h、48 h、72 h、96 h取樣，感染96 h收毒，樣品于2 000 r/min離心5 min，移取上清于干凈的EP管中，細(xì)胞沉淀用等體積PBS重懸。分別于72 h收毒

1.2.2和1.2.3試驗(yàn)方法進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增2b-Cap序列。從圖4的電泳結(jié)果可以看出，擴(kuò)增的2b-Cap序列電泳位置與預(yù)期一致大小為720 bp左右。從圖5可見，XhoⅠ/KpnⅠ雙切得到兩條帶，上面條帶是載體序列，下面條帶是2b-Cap序列，結(jié)果與預(yù)期條帶大小一致，同時測序結(jié)果（略）也證明2b-Cap序列已經(jīng)成功插入到目的載體中，質(zhì)粒PMP10-Fastdual-2b構(gòu)建正確。

圖4 PM-P10-Fastdual-2b質(zhì)粒PCR驗(yàn)證

2.2 重組Bacmid-2b構(gòu)建和鑒定 按照1.2.4的方法構(gòu)建重組rBacmid-2b，挑選3個白斑和1個藍(lán)斑進(jìn)行鑒定，引物為M13上下游引物。由圖6的結(jié)果可見，挑取的3個白斑，經(jīng)純化后，菌落PCR大小為6 000 bp左右，與預(yù)期一致，因此，挑取的3個克隆均為陽性。純化后的單克隆菌液PCR條帶單一，沒有野毒條帶污染，桿粒制備成功。

圖5 PM-P10-Fastdual-2b質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

圖6 重組桿粒PCR鑒定

2.3 重組病毒的獲得與IFA鑒定 試驗(yàn)選取純化后的2個單克隆轉(zhuǎn)接至6 mL三抗LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，用異丙醇沉淀法提取重組桿粒并純化，隨后按照1.2.5的方法轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，收獲P1代病毒。病毒傳代，按照1.2.6的方法對P2代RAC-2bCap毒進(jìn)行IFA鑒定。由圖7可見，P2代重組病毒相比空白細(xì)胞有明顯的綠色熒光，初步驗(yàn)證b2-Cap蛋白表達(dá)。

2.4 重組蛋白表達(dá)鑒定

2.4.1 SDS-PAGE鑒定 按照1.2.7的方法步驟，接種量為0.1 MOI，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取混懸液，離心后取上清、細(xì)胞重懸液制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。從圖9的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，2b-Cap蛋白在細(xì)胞沉淀中得到表達(dá)，且隨著時間蛋白表達(dá)有增長的趨勢，表達(dá)量可達(dá)300μg/mL左右，但是該蛋白為不可溶表達(dá)，沒有分泌到上清中，蛋白大小為28 kD左右。

圖7 IFA鑒定重組病毒

圖8 SDS-PAGE驗(yàn)證2b表達(dá)

2.4.2 Western-blotting鑒定2b-Cap表達(dá) SDSPAGE電泳圖譜證明2b-Cap得到表達(dá)，為了進(jìn)一步證實(shí)該蛋白為2b-Cap蛋白，對樣品進(jìn)行了Western-blotting分析，試驗(yàn)按照1.2.7的方法進(jìn)行。由Western-blotting結(jié)果可見，24 h、48 h、72 h、96 h時2b-Cap蛋白都有表達(dá)，條帶大小為2 828 kD左右，且隨著培養(yǎng)時間延長，蛋白表達(dá) 量增加，證明2b-Cap蛋白在重組桿狀病毒中得到表達(dá)。

3 結(jié)果和討論

圖9 2b-Cap蛋白的Western-blotting驗(yàn)證

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白用于疫苗生產(chǎn)已經(jīng)非常成熟，其可以進(jìn)行大規(guī)模的表達(dá)生產(chǎn)，生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)量高，蛋白翻譯后加工比細(xì)菌、酵母生產(chǎn)系統(tǒng)完善，而且由于昆蟲桿狀病毒具有限制性的宿主范圍，只對特定種屬的昆蟲及其細(xì)胞進(jìn)行感染，對人畜等脊椎動物沒有感染能力，因此，具有比在哺乳動物及其培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)更為安全等優(yōu)點(diǎn)而成為目前最有效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。但是外源蛋白的表達(dá)量依據(jù)培養(yǎng)條件、細(xì)胞狀態(tài)種類、培養(yǎng)基的質(zhì)量以及外源基因本身的性質(zhì)，有著很大差別。本單位先前利用商品化的pFastBacTMDual作為載體表達(dá)PCV2b的Cap蛋白，蛋白表達(dá)量非常低，無法滿足后續(xù)的試驗(yàn)需求，因此，本試驗(yàn)根據(jù)昆蟲密碼子優(yōu)化合成了PCV2b的Cap基因，同時構(gòu)建了添加增強(qiáng)子序列的PM-P10-Fastdual載體，通過分子克隆的方

法構(gòu)建了重組桿狀病毒PCV2b Cap蛋白高表達(dá)載體PM-P10-Fastdual-2b，通過桿粒制備及轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞獲得了表達(dá)豬PCV2b Cap蛋白的重組桿狀病毒株，IFA、SDS-PAGE及WB驗(yàn)證該毒株可以表達(dá)PCV2b Cap蛋白，該蛋白以胞內(nèi)沉淀形式表達(dá)，但是表達(dá)量明顯提高。該試驗(yàn)為下一步制備PCV2b Cap蛋白亞單位疫苗打下了基礎(chǔ)。