高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定葡萄酒中甜味劑、防腐劑和色素

王麗娟 ，柯潤輝 ，安紅梅 ，楊春艷 ，山樹棠 ，尹建軍

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京100015； 2.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,北京100015）

食品添加劑是現(xiàn)代食品工業(yè)中不可缺少的一部分，人工合成色素、甜味劑和防腐劑作為重要的食品添加劑被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)加工[1-2]。但是，隨著其在食品行業(yè)的廣泛使用，違規(guī)及超限量使用事件時有發(fā)生，所帶來的食品安全問題也日益凸顯，安全監(jiān)管問題已被列入食品安全整頓工作的重要內(nèi)容[3-4]。隨著人們生活水平的提高及對健康的關(guān)注，葡萄酒慢慢取代了酒精度較高的白酒，成為了很多宴請和聚餐的“新寵”，消費量呈現(xiàn)日益增長的趨勢[5]，但葡萄酒市場仍有不少違法使用添加劑或者添加劑超標(biāo)的現(xiàn)象，甚至有不法商販利用香精、色素、酒精、甜味劑等添加劑進(jìn)行勾兌，制造假冒偽劣葡萄酒產(chǎn)品，擾亂葡萄酒市場，危害消費者健康[6-7]。近年來，國家有關(guān)部門在對全國葡萄酒的抽檢過程中發(fā)現(xiàn)，濫用添加劑現(xiàn)象時有發(fā)生，因此葡萄酒中違規(guī)使用的添加劑也成為國家食品安全監(jiān)督抽檢的重點項目。隨著我國食品安全監(jiān)管水平的提升，為提高工作效率，方便監(jiān)管部門和生產(chǎn)企業(yè)對葡萄酒中防腐劑、甜味劑和色素的日常監(jiān)測，開發(fā)靈敏度高、適用性廣的高通量檢測方法以有效地應(yīng)對添加劑在葡萄酒中的濫用，以及應(yīng)對突發(fā)食品安全事件具有重要的現(xiàn)實意義[8]。

為保障食品安全，需要對葡萄酒中食品添加劑的含量進(jìn)行檢測。目前，國標(biāo)[9-11]有針對葡萄酒中防腐劑、色素和甜味劑等的檢測方法，但這些標(biāo)準(zhǔn)大都針對單一或某幾種食品添加劑，且樣品的預(yù)處理方法各不相同，對于葡萄酒中多種添加劑則需要逐一測定，程序繁雜，檢測時間長，效率很低[6，12]，在進(jìn)行批量樣品檢測時，需要大量的人力物力。近年來，國內(nèi)外關(guān)于葡萄酒中防腐劑、甜味劑和色素檢測方法的文獻(xiàn)報道很多，主要采用離子色譜法[13]、氣相色譜法[14]、高效液相色譜[15-16]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[17-18]等，雖然相關(guān)檢測方法的報道很多，在檢測靈敏度和準(zhǔn)確度方面均有所提高，但經(jīng)文獻(xiàn)檢索，大多只針對某一類添加劑進(jìn)行檢測，不利于對葡萄酒中多類添加劑的大規(guī)模篩查。另外，包括我國國家標(biāo)準(zhǔn)在內(nèi)，目前最為普遍的分析方法為液相色譜法[19-20]，該方法不能提供目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，抗干擾能力相對較弱，在實際樣品分析時容易受到基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象[5，21]。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠在一定程度上降低基質(zhì)干擾，對于需要高靈敏度、寬適用范圍的檢測工作而言，已成為最佳的手段之一，逐漸應(yīng)用于添加劑的檢測[22]。本實驗采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，利用高效液相色譜的強分離能力和質(zhì)譜準(zhǔn)確定性、高選擇性和高靈敏度的特點，在較短的時間內(nèi)即可完成多組分的分離鑒定，建立了一種可同時測定并能夠準(zhǔn)確定性定量葡萄酒中防腐劑、甜味劑和色素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葡萄酒樣：購自零售超市和商店。

儀器設(shè)備：LCMS-8050高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司，具體配置為LC-20ADXR×2輸液泵，DGU-20A3R在線脫氣機，SIL-20AXR自動進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器，LCMS-8050三重四極桿質(zhì)譜儀，Lab-Solutions Ver.5.91色譜工作站）；Milli-Q Reference超純水器（美國Millipore公司）；超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm，美國Waters公司）；0.22 μm尼龍濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：甲醇、乙腈、乙酸、乙酸銨（HPLC級，Dikma公司）；甜蜜素（Sodium cycamate）、安賽蜜（Acesulfame-K）、糖精鈉（Saccharin sodium）、阿斯巴甜（Aspartame）、三氯蔗糖（Sucralose）、甜菊糖苷（Stevioside）、紐甜（Neotame）、阿力甜（Alitame）；誘惑紅（Allura red）、赤蘚紅（Erythrosine）、莧菜紅（Amaranth）、胭脂紅（Carmine）、檸檬黃（Tartrazine）、日落黃（Sunset yellow）、亮藍(lán)（Brilliant blue）；脫氫乙酸（Dehydroacetic acid），美國Sigma-Aldrich公司，加拿大TRC公司和德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥95%。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取16種添加劑標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用水或甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)儲備液，于-18℃下避光保存。用甲醇稀釋并配制中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃避光保存。根據(jù)需要用流動相逐級稀釋，配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品前處理方法

取葡萄酒樣品2.0 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容，超聲混勻，過0.22 μm濾膜，濾液供測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8 μm，美國Waters公司）。流動相：（A）甲醇和（B）10 mmol/L乙酸銨水溶液，流速0.35 mL/min；梯度洗脫程序為：0 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為10%；0～3 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)從10%升至90%，并保持2.5 min，5.5～5.51 min；甲醇的體積分?jǐn)?shù)從90%降至10%；5.51 min～6.5 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)保持10%。柱溫為35℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

分析儀器：LCMS-8050；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正負(fù)離子同時掃描；離子源接口電壓：0.5 kV；霧化氣：氮氣3.0 L/min；干燥氣：氮氣10 L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；駐留時間：15 ms；延遲時間：3 ms；16種添加劑標(biāo)準(zhǔn)品MRM參數(shù)見表1。

表1 16種添加劑的保留時間和質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

與其他分析手段不同，質(zhì)譜分析往往存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)使用ESI源時，在離子化過程中基質(zhì)組分與目標(biāo)物競爭，更易出現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)。減少基質(zhì)效應(yīng)的方法通常有稀釋樣品溶液、增加凈化步驟、配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液等[23]。本研究采用直接進(jìn)樣方式進(jìn)行分析，以避免傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取方法回收率低、重復(fù)性差，且會使用大量溶劑的弊端，但考慮到葡萄酒中含有一定比例乙醇和糖類，為減少基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響，需對樣品進(jìn)行稀釋處理。稀釋的方法可以降低乙醇對色譜峰形影響，減弱基質(zhì)效應(yīng)，但是會降低方法的檢出限。經(jīng)過對主流品牌的葡萄酒分別稀釋2～15倍進(jìn)行檢測，不同稀釋倍數(shù)樣品測試對比，最終確定稀釋倍數(shù)為5倍。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

反相色譜的流動相通常由水和有機溶劑（如甲醇、乙腈）等組成，由于某些被測物極性較強，流動相的洗脫能力不宜過強，同時待分離的16種添加劑有些極性相近，保留時間相近，采用乙腈為有機相時導(dǎo)致幾個組分“共流出”情況較甲醇嚴(yán)重，而甲醇可使16種添加劑的保留時間相對延遲，同時甲醇可以提高離子化程度，峰面積比用乙腈為流動相時大，故選擇甲醇為實驗的有機相；又由于流動相要進(jìn)入質(zhì)譜儀，添加一定量的緩沖溶液可以增加響應(yīng)值，所以考慮甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-乙酸水溶液3種流動相體系。以被測物在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度等為考察指標(biāo)對3種流動相體系進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，體系中添加了乙酸銨不僅更有利于分離物質(zhì)在色譜柱上的保留，而且能夠提高色素類物質(zhì)的電離化程度，增加信號響應(yīng)，從各物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時間的穩(wěn)定性等指標(biāo)進(jìn)行綜合衡量，甲醇-10 mmol/L乙酸銨作為流動相時，優(yōu)于其余兩種流動相，故實驗選用甲醇-10 mmol/L乙酸銨為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

2.2.2 柱溫的選擇

柱溫能夠影響色譜柱的柱效、選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性，柱溫的改變直接影響分離效果及分離速率。升高柱溫，色譜柱內(nèi)離子交換速率隨之升高，有利于提高柱效、縮短分析時間[24]。本實驗考察了柱溫分別為30℃、35℃、40℃時，16種添加劑保留時間及響應(yīng)值的差別，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為30℃時，16種添加劑有13種出峰時間均集中在3～4 min，分離度差；提高柱溫至35℃時，柱效提高，分離度和靈敏度均有改善，繼續(xù)提高柱溫，分離情況無明顯變化?？紤]到色譜柱在相對較低溫度下使用壽命較長，本實驗設(shè)定柱溫為35℃。優(yōu)化條件下16種添加劑的MRM質(zhì)譜圖見圖1。

2.2.3 質(zhì)譜條件的選擇

為獲得最佳的靈敏度和分離效果，根據(jù)16種添加劑的分子結(jié)構(gòu)特征，在正、負(fù)兩種電離模式下優(yōu)化被測物的母離子和特征子離子以及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)。取質(zhì)量濃度為1 mg/L的16種化合物單標(biāo)準(zhǔn)溶液依次采用不接色譜柱直接進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜全掃描檢測，得到目標(biāo)分析物一級質(zhì)譜圖，再用氬氣轟擊該母離子，得到其二級質(zhì)譜圖，利用儀器的自動優(yōu)化功能，分別對Q1、Q3、CE等進(jìn)行優(yōu)化，確定16種添加劑的母離子和子離子的最佳質(zhì)譜條件，以強度較大的子離子作為定量離子，強度稍小的子離子為定性離子，各化合物的定量離子及定性離子見表1。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下16種被測物的總離子流（TIC）圖見圖1。

圖1 16種添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 方法的線性范圍和檢出限

將含16種被測物的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液添加至稀釋5倍的空白葡萄酒樣品中，分別配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2部分所確定的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，以各組分定量離子色譜峰面積對相應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制各被測物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）都在0.995以上。

表2 16種被測物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

用葡萄酒樣品低加標(biāo)水平計算各組分的檢出限和定量限，用信噪比為3確定方法的檢出限（LOD），用信噪比為10確定方法的定量限（LOQ），各組分在葡萄酒樣品中的檢出限范圍在0.2～2 μg/L之間。結(jié)果見表2。

2.3.2 精密度和回收率

用微量移液器向空白葡萄酒樣品中準(zhǔn)確加入一定量的16種待測物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成低、中、高3個濃度水平進(jìn)行回收率實驗，按1.2節(jié)所述實驗步驟進(jìn)行處理和測定，進(jìn)行6次重復(fù)實驗，計算其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，各目標(biāo)物平均回收率在89.1%～106.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.7%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合多殘留分析的要求。

2.4 實際樣品的測定

按所建立的方法對采購的10批次葡萄酒樣品進(jìn)行了16種添加劑的篩查，每個樣品重復(fù)測定3次。所檢葡萄酒樣品中有1個檢出糖精鈉和甜蜜素，含量分別為26.3 μg/L、38.9 μg/L，其余樣品的檢測結(jié)果均為陰性。陽性樣品的MRM質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 某葡萄酒樣品中檢出的糖精鈉和甜蜜素質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時測定葡萄酒中甜味劑、防腐劑和色素含量的方法，前處理簡單、分析速度快、準(zhǔn)確度和靈敏度高。實際樣品的檢測表明，該方法能夠滿足葡萄酒甜味劑、防腐劑和色素殘留的分析要求，與國標(biāo)方法相比，大大提高了分析效率和降低了分析成本，能夠滿足葡萄酒中痕量分析要求，非常適合大批量葡萄酒樣品中16種添加劑的定性和定量分析。