I群禽腺病毒的分離鑒定與同源性分析

矯海婷，張 燦，劉德萍，宋翠萍，李東陽，任慧英，吳延功

（1. 青島農業(yè)大學，山東青島 266109；2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3. 榮成市城西畜牧獸醫(yī)站，山東榮成 264300）

I群禽腺病毒（FAdV-I）最早于1963年在美國首次被報道，可廣泛感染家禽和野禽。2013年，我國開始報道在雞群中發(fā)現(xiàn)該病毒。2015年該病毒在山東、河南、江蘇、河北以及東北等地區(qū)流行，感染家禽主要表現(xiàn)為心包積液和肝臟腫大，又稱“心包積液-肝炎綜合征”。近年來，該病毒在我國各地雞群中的流行狀況日益嚴重，導致雞群死淘率升高，造成嚴重經(jīng)濟損失[1-2]。FAdV-I根據(jù)限制性酶切圖譜分為A、B、C、D、E 5個種，根據(jù)血清交叉中和反應又分為12個血清型[3]。FAdV-I屬于腺病毒A型，在我國流行的血清型主要為4、8和11型[4-6]。PCR 技術現(xiàn)已廣泛應用于動物傳染病診斷。目前已經(jīng)報道了基于六鄰體蛋白（Hexon）、DNA 聚合酶等基因建立的FAdV-I各血清型PCR診斷方法[8-10]。Hexon位于FAdV-I病毒粒子表面，是主要的中和抗原和保護性抗原，與病毒的分型和致病性密切相關，通常用于FAdV-I的診斷和疫苗研發(fā)[7]。本試驗主要針對山東、吉林、黑龍江等地的發(fā)病禽類進行FAdV-I分離，針對Hexon基因進行PCR鑒定，并對分離到的FAdV-I毒株進行分子流行病學分析，從分子水平了解當前FAdV-I的流行特征，以期為該病毒防控和疫苗研發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病料、雞胚及細胞株

疑似FAdV-I感染的病死雞病料（76份）：取自山東、吉林、黑龍江等地的病死雞；SPF雞胚：來自青島康信孵化場；雞肝癌細胞（LMH）（貨號BNCC337930）：購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank公布的Hexon基因序列（MG734665.1）設計FAdV-I特異性引物，送青島華大基因研究所合成。序列如下：FAdV-I-F： GGTCGACCTATTTCGACATCAAG；FAdV-I-R：CAGCTCGACCACCACGTTCATG。預期擴增的目的條帶大小為742 bp。

1.2.2 病料處理 剖解疑似發(fā)病雞，采集肝臟病料樣品，加入5倍體積的無菌PBS；將肝臟病料研磨成勻漿，反復凍融3次，4 000 r/min離心5 min，取上清，經(jīng)0.22 μm無菌濾器過濾，將濾液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒DNA提取 取50～100 mg肝臟病料，剪碎后加入500 μL 10% 的SDS和8 μL蛋白酶K，55 ℃水浴6 h；取上清，分別加入400 μL氯仿和平衡酚抽提，振蕩15 s，4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min；取上清重復抽提2～3次，直至上清液清晰透明；取上清，加入2倍體積的無水乙醇混勻，-20 ℃ 條件下靜置 30～60 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，棄上清；在沉淀中加入75%的無水乙醇，輕輕混勻，4 ℃ 12 000 r/min，離心10 min，棄上清；將沉淀重復洗2次，棄上清，稍晾干，加入ddH2O 30 μL重溶，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病毒PCR檢測 以提取的病毒DNA為模板、FAdV-I-F/FAdV-I-R為引物進行PCR擴增，反應體系及反應條件見表1。PCR反應條件：對擴增的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下察看電泳結果，將擴增得到的PCR產(chǎn)物送青島華大基因研究所測序，對測序結果與NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析。

表1 PCR反應體系及反應條件

1.2.5 病毒分離與傳代 將PCR檢測陽性的病死雞肝臟病料無菌條件下制備組織勻漿，反復凍融3次，4 000 r/min離心15 min；0.22 μm濾器過濾，取0.2 mL濾液接種9～11 d的SPF雞胚尿囊腔，每個樣品接種5枚；同時設接種生理鹽水對照組。將接種雞胚在37 ℃培養(yǎng)箱孵育，每天照蛋2次，觀察雞胚死亡情況；棄去24 h內死亡的雞胚，收集24～96 h死亡的雞胚尿囊液，盲傳3代；將未致死雞胚在5 ℃條件下靜置4 h以上，收集尿囊液。將收集的尿囊液和肝組織勻漿用0.22 μm濾器過濾除菌，分別接種生長至80%～90%的雞肝癌細胞（LMH），于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育1～2 h，然后加入含有2%胎牛血清和1%雙抗的細胞培養(yǎng)液，72 h內觀察細胞病變，收集病毒，-80 ℃冰箱保存。

2 結果與分析

2.1 病毒分離及鑒定

病死雞病理剖檢主要表現(xiàn)為心包積液，肝臟腫大，有出血點或出血斑等病理變化，初步推測為FAdV-I感染（圖1）。從76份病料中分別提取總DNA，以FAdV-I-F/FAdV-I-R為引物進行PCR擴增。1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，有10份樣品經(jīng)PCR擴增得到了742 bp大小的目的條帶，與預期片段大小相同（圖2），F(xiàn)AdV-I陽性檢出率為13%。

圖1 病死雞病理剖檢病變

圖2 FAdV-I PCR擴增結果

2.2 病毒分離株序列分析

樣品的PCR鑒定結果顯示，擴增得到的10個目的片段均為FAdV-I的Hexon基因片段，因此確定10份病料樣品中含有FAdV-I。根據(jù)病料來源及送檢時間，分別將毒株命名為SDWF170315、SDQD161224、SD161115、SDWF170706、SD170728、SDBZ170314、LN170514、LN170531、HLJ170728、SDWF171208。

將10株FAdV-I序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)這10株FAdV-I的血清型可分為4種：SDWF171208為血清4型，與厄瓜多爾來源毒株同源性最高；SDWF170706、SD170728、HLJ170728、LN170514、LN17053、SDBZ170314為血清8b型，與秘魯、厄瓜多爾、韓國、匈牙利等國家毒株的同源性最高；SD161115為血清型9型，與我國湖北省分離到的毒株同源性最高；SDWF170315、SDQD161224為血清11型，分別與沙特阿拉伯、美國毒株的同源性最高（圖3）。

2.3 病毒分離與傳代

2.3.1 雞胚病毒培養(yǎng) 利用雞胚接種尿囊腔，共分離到10株FAdV-I。將分離到的毒株分別在雞胚上盲傳3代，發(fā)現(xiàn)雞胚在72 h內均死亡，死亡雞胚主要表現(xiàn)為皮下、背部出血，肝臟腫大、出血。與正常雞胚相比，死胚胚體明顯小于正常雞胚，說明病毒影響了雞胚的生長發(fā)育。

2.3.2 細胞病毒培養(yǎng) 將分離到的10株FAdV-I接種生長至70%～90% 的LMH細胞，發(fā)現(xiàn)72 h左右即產(chǎn)生了明顯的細胞病變。正常的細胞形態(tài)呈扁圓鋪路石狀（圖4-A），而病變細胞變大、變圓，集聚成不規(guī)則的葡萄串似的串珠狀，細胞間隙增大，最終致細胞崩解（圖4-B）。

3 討論

近年來，F(xiàn)AdV-I在我國各地廣泛流行，嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)。本試驗從山東、吉林、黑龍江等地送檢的病料中分離FAdV-I并進行PCR鑒定，可以了解這些地區(qū)的FAdV-I流行現(xiàn)狀。

FAdV-I在雞胚尿囊腔和LMH細胞系上生長良好。病毒接種雞胚后，在雞胚不同部位的滴度各不相同。本試驗發(fā)現(xiàn)卵黃囊中的病毒滴度最高。另外，雞胚接毒的前幾代收毒后，用PCR方法檢測不到病毒，繼續(xù)盲傳后，才能獲得陽性結果。分析其原因可能是病毒在雞胚或細胞系上培養(yǎng)需要一個傳代適應過程。LMH細胞系具備比雞胚原代肝細胞更強的增殖能力，目前已成功用于FAdV-I多個血清型毒株的培養(yǎng)和增殖[11]。本試驗發(fā)現(xiàn)，部分病料同時接種雞胚和LMH細胞系，結果在LMH細胞中未觀察到病變，而雞胚卻被致死；隨后將雞胚中收集的病毒繼續(xù)接種LMH細胞，發(fā)現(xiàn)細胞產(chǎn)生病變，因而推測雞胚更有利用于病毒的分離和傳代。

圖3 FAdV-I分離株同源性分析結果

FAdV-I包括12種血清型，不同血清型毒株引起的臨床癥狀和病理變化存在差異，其中1、2、4和8型均能引起心包積液-肝炎綜合征。牛登云等[12]報道2014—2016年我國雞群中普遍存在腺病毒感染，且引起死淘率升高，臨床上主要以4型和8型為主。4型主要引起心包積液，而8b型主要引起包涵體肝炎。尹燕博[13]對 2007—2017年我國主要養(yǎng)殖區(qū)流行的禽腺病毒進行檢測，發(fā)現(xiàn)主要血清型依次為11、4和8型，且常與雞傳染性貧血病病毒混合感染。本試驗從76份病料中共分離到10株FAdV-I， 其中 6株 為 8b型，2株為11型，另2株分別為4和9型，提示山東、吉林、黑龍江等地流行的FAdV-I以8b型為主。FAdV-I在2014年之前主要以11型流行為主，2014年之后，蛋雞中流行的以4型為主，肉雞中流行的仍以11型為主，2017年之后8型檢出率明顯升高[13]。本試驗通過分離毒株的血清型鑒定，也證實了當前FAdV-I的流行血清型在分離地區(qū)已經(jīng)轉變?yōu)橐?型為主。當前腺病毒感染的防控主要以免疫血清4型滅活疫苗為主。鑒于不同血清型不能提供完全的交叉保護，當雞群中流行的FAdV-I血清型發(fā)生轉變后，往往導致免疫失敗。本次從山東、吉林、黑龍江等地分離到的FAdV-I毒株中，8b血清型占到60%，暗示著當前的4型滅活疫苗不能有效防控該病。這應引起養(yǎng)禽業(yè)足夠的重視，需制備相應血清型疫苗。

圖4 FAdV-I培養(yǎng)在LMH細胞系（10×）

4 結論

本研究對山東、黑龍江、吉林等地規(guī)模養(yǎng)雞場的76份疑似FAdV-I感染病料，進行病毒分離、PCR鑒定及同源性分析，結果從上述地區(qū)樣品中均分離到病毒，共計10株，分離率為13%；鑒定出4種血清型，其中血清8b型6株，占比60%。這說明山東、黑龍江、吉林等地均存在一定的FAdV-I流行，優(yōu)勢血清型轉變?yōu)?b型，因此需制備相應的血清型疫苗來有效防控這些地區(qū)AdV-I流行。