沙門氏菌LAMP可視化檢測方法的建立

高志強(qiáng)，汪 琳，張 燦，任 彤，趙相鵬，尹 羿，蒲 靜，史雅然，劉鳳華

（1.北京檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026；2.中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所，北京 100071；3.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206）

沙門氏菌病是一種常見的人畜共患病，臨床上以敗血癥和急慢性腸炎為特征，但染病動(dòng)物常常不出現(xiàn)明顯臨床癥狀。沙門氏菌主要定殖于動(dòng)物小腸，可持續(xù)性或間斷性從糞便排出，從而污染環(huán)境。沙門氏菌屬包含2個(gè)種，即腸道沙門氏菌（S.enterica）和邦戈沙門氏菌（S. bongori）[1]，腸道沙門氏菌又包含6個(gè)亞種。沙門氏菌病的感染過程、臨床表現(xiàn)、病理及流行病學(xué)特征與菌株特征和動(dòng)物種類相關(guān)。一般來說，幼齡動(dòng)物和懷孕動(dòng)物最易感。多數(shù)血清型的菌株能引起多種動(dòng)物發(fā)病。某些血清型的菌株具有宿主特異性，如羊流產(chǎn)沙門氏菌，豬霍亂沙門氏菌，駝都柏林沙門氏菌，雞白痢和禽傷寒沙門氏菌以及馬流產(chǎn)沙門氏菌，這些血清型的菌株或引起動(dòng)物的敗血癥，或?qū)е聞?dòng)物的細(xì)菌性下痢，有的則引起懷孕動(dòng)物流產(chǎn)。沙門氏菌還是一種具有重要公共衛(wèi)生意義的微生物，據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）統(tǒng)計(jì)，每年全美約有120萬人發(fā)生沙門氏菌感染，超過2.3萬人住院[2]。通常的感染原因是食用了被沙門氏菌污染的肉、蛋、奶等，也可通過與感染沙門氏菌的鳥、家畜、犬、貓以及兩棲和爬行動(dòng)物接觸而發(fā)生感染，其中豬霍亂沙門氏菌和都柏林沙門氏菌可引起人的嚴(yán)重疾病。

由于動(dòng)物的沙門氏菌病從臨床表現(xiàn)上很難與其他疫病鑒別，通常需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，傳統(tǒng)的檢測方法大多為增菌和選擇培養(yǎng)，然后通過生化方法和血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定，一般需要4 d以上。替代性檢測方法包括免疫磁珠分離方法、定量RTPCR方法、ELISA以及芯片檢測方法[3-4]，這些方法都不能實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的快速現(xiàn)場檢測。本研究采用基于HNB可視化顯色的方法，針對(duì)沙門氏菌侵襲因子A基因（invA）建立了LAMP檢測技術(shù)，通過特異性和靈敏度評(píng)價(jià)，將其應(yīng)用于進(jìn)境動(dòng)物樣本檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 核酸及被檢樣品 大腸桿菌top10、鼠傷寒沙門氏菌Sal-BJ01、腸炎沙門氏菌Sal-BJ02、志賀氏菌（BJ01）DNA，以及豬鏈球菌2型C55606 DNA ：本實(shí)驗(yàn)室保存；布魯氏菌試管凝集抗原、炭疽沉淀抗原、雞白痢及禽傷寒沙門氏菌凝集抗原以及馬流產(chǎn)試管凝集抗原：購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；猴糞拭子樣品200份：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）：購自天根生化科技有限公司；Bst DNA聚合酶：購自NEB公司；dNTP等：購自TaKaRa公司；羥基萘酚藍(lán)（HNB）：購自Fluka公司；毛細(xì)管電泳儀QIAxcel：QIAGEN公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)已知的沙門氏菌侵襲因子A基因（invA）序列，使用在線軟件Primer Explorer version 4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html ）設(shè)計(jì)1套LAMP引物。設(shè)計(jì)的引物經(jīng)blast分析確認(rèn)其保守性，委托上海生工進(jìn)行合成。引物探針名稱、序列及靶基因見表1。

表1 引物名稱、序列及靶基因

1.2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化 采用25μL 體系，以5 μL 10-5稀釋的沙門氏菌DNA作為模板，基礎(chǔ)體系為1×ThermoPol 緩沖液、16U Bst DNA聚合酶，betaine 濃度固定為0.8 mol/L，HNB濃度固定為0.12 mmol/L，dNTPs濃度固定為200 nmol/L，外引物量固定為5 pmol。內(nèi)引物量從40～120 pmol，以20 pmol量遞增；MgSO4濃度從1.0～5.0 mmol/L，以0.5 mmol/L遞增；篩選最適合MgSO4濃度和最佳內(nèi)引物量。反應(yīng)條件為60 ℃ 1 h。

1.2.3 反應(yīng)溫度優(yōu)化 為確定最佳反應(yīng)溫度，LAMP 從 60～65℃ ，以 1 ℃ 進(jìn)行遞增，對(duì) 5 μL 鼠傷寒沙門氏菌DNA進(jìn)行檢測，以10 min為間隔，觀察反應(yīng)管顏色變化，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.4 靈敏度試驗(yàn) 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌Sal-BJ01菌液，通過平板計(jì)數(shù)測定其濃度，然后使用滅菌生理鹽水作10倍倍比稀釋，應(yīng)用優(yōu)化的反應(yīng)體系，分別對(duì)0.2 mL 10-2～10-7稀釋的沙門氏菌DNA進(jìn)行檢測，確定其檢測靈敏度。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的反應(yīng)體系對(duì)大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA、豬鏈球菌2型C55606DNA、布氏桿菌試管凝集抗原DNA、炭疽沉淀抗原DNA、腸炎沙門氏菌Sal-BJ02 DNA、雞白痢及禽傷寒沙門氏菌凝集抗原DNA以及馬流產(chǎn)試管凝集抗原DNA進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別對(duì)0.2 mL 10-3～10-5稀釋的沙門氏菌菌液提取DNA，應(yīng)用建立的LAMP方法進(jìn)行檢測，每個(gè)稀釋度均進(jìn)行3次重復(fù)，以驗(yàn)證方法的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.7 進(jìn)境動(dòng)物檢疫樣品檢測 對(duì)本單位收集的200份猴糞拭子樣品進(jìn)行驗(yàn)證，為保證檢出率并去除死菌DNA干擾，首先使用亞硒酸鹽培養(yǎng)基（SF）進(jìn)行增菌后，然后應(yīng)用建立的LAMP方法與細(xì)菌分離鑒定同步進(jìn)行檢測比較。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系優(yōu)化

經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)確立最終反應(yīng)體系：5 μL RNA 模板，1×ThermoPol 緩沖液，4 mol/L betaine 5 μL，0.1 mol/L MgSO40.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，3 mmol/L HNB 1 μL，5 pmol F3 和 B3，40 pmol FIP和 BIP，20 pmol LF和 BF，16U Bst DNA聚合酶。陽性反應(yīng)管為天藍(lán)色，而陰性反應(yīng)管為紫羅蘭色，顯色反應(yīng)結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

2.2 反應(yīng)溫度試驗(yàn)

反應(yīng)溫度試驗(yàn)結(jié)果顯示，61 ℃效果最好，因此選擇61 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

經(jīng)平板計(jì)數(shù)測定，鼠傷寒沙門氏菌Sal-BJ01菌液濃度為3.6×107CFU/mL，應(yīng)用建立的LAMP反應(yīng)體系可以檢出0.2 mL稀釋至3.6×101CFU/mL菌液所提取的DNA（圖1）。對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行電泳，可見特異性梯狀條帶（圖2）。結(jié)果表明，該方法的檢測靈敏度為3.6×101CFU/mL。

圖1 LAMP 靈敏度試驗(yàn)眼觀檢測結(jié)果

圖2 LAMP 靈敏度試驗(yàn)電泳檢測結(jié)果

2.4 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的反應(yīng)體系對(duì)腸炎沙門氏菌Sal-BJ02 DNA、雞白痢及禽傷寒沙門氏菌凝集抗原DNA、馬流產(chǎn)試管凝集抗原DNA、大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA、豬鏈球菌2型C55606DNA、布氏桿菌試管凝集抗原DNA以及炭疽沉淀抗原DNA進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證方法的特異性。結(jié)果顯示，可以檢出腸炎沙門氏菌Sal-BJ02 DNA、雞白痢及禽傷寒沙門氏菌DNA和馬流產(chǎn)試管凝集抗原DNA，但不能檢出其他病原核酸（圖3）。

圖3 LAMP 特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

連 續(xù) 3次分別對(duì)稀釋至 3.6×104～3.6×102CFU/mL 0.2 mL菌液提取的DNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，3個(gè)稀釋度菌液DNA的3次重復(fù)檢測均為陽性，表明所建立方法的重復(fù)性可以滿足要求。

2.6 送檢樣品檢測

對(duì)200份進(jìn)境猴糞拭子樣品經(jīng)亞硒酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行增菌，應(yīng)用建立的檢測方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)2份為陽性，與分離鑒定的檢測結(jié)果完全一致，表明建立的方法適用于進(jìn)境動(dòng)物樣品的檢測。LAMP眼觀結(jié)果見圖4，產(chǎn)物毛細(xì)管電泳結(jié)果見圖5。

圖4 2份陽性樣品的眼觀檢測結(jié)果

3 討論

圖5 2份陽性樣品LAMP 產(chǎn)物毛細(xì)管電泳結(jié)果

沙門氏菌病可以造成多種動(dòng)物感染，臨床上往往難以鑒別。例如幼齡禽類感染沙門氏菌，其敗血型臨床表現(xiàn)與其他很多細(xì)菌類感染非常相似；禽沙門氏菌感染引起的關(guān)節(jié)炎臨床上與其他病原引起的滑膜炎或滑囊炎難以鑒別；豬霍亂沙門氏菌引起豬的敗血性病變與豬瘟相似；小牛的急性沙門氏菌性腸炎與牛的球蟲病癥狀相似。此外，羊流產(chǎn)沙門氏菌、貝氏柯克斯體、羊流出衣原體和羊布氏桿菌等均可引起綿羊流產(chǎn)，同樣難以從臨床上鑒別[2]。對(duì)于沙門氏菌病的病原檢測，經(jīng)典方法仍然是細(xì)菌分離培養(yǎng)，費(fèi)事耗力。替代性檢測方法包括免疫磁珠分離結(jié)合ELISA或PCR的檢測，其可在24 h完成，但檢測流程相對(duì)復(fù)雜。對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行檢測可進(jìn)一步縮短時(shí)間并簡化流程，目前已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用，但主要見于食品中沙門氏菌的檢測應(yīng)用[5]。因此，需要加強(qiáng)研制快速檢測沙門氏菌的方法。

本研究以進(jìn)境動(dòng)物檢疫樣品中沙門氏菌invA基因作為檢測目標(biāo)，設(shè)計(jì)了一套針對(duì)8個(gè)檢測區(qū)域的LAMP引物，建立了沙門氏菌的LAMP檢測技術(shù)。由于引物設(shè)計(jì)對(duì)于LAMP方法建立至關(guān)重要，引物序列往往決定了LAMP方法的靈敏度和特異性。研究表明沙門氏菌inv基因家族具有屬特異性，因此本研究選擇沙門氏菌的屬特異性基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的引物可覆蓋6個(gè)亞種的腸道沙門氏菌，并經(jīng)本研究驗(yàn)證可特異性檢出鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，雞白痢和禽傷寒沙門氏菌凝集抗原以及馬流產(chǎn)沙門氏菌試管凝集抗原，但與其他動(dòng)物病原菌DNA無交叉反應(yīng)。

LAMP開蓋檢測容易發(fā)生氣溶膠污染，因此采用更嚴(yán)格的分區(qū)管理措施非常必要。此外，通過加入指示劑實(shí)現(xiàn)可視化判定對(duì)于防止污染、簡化流程具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究使用了HNB作為指示劑，陽性反應(yīng)管呈天藍(lán)色，而陰性反應(yīng)管仍為紫羅蘭色。由于進(jìn)出口動(dòng)物檢疫樣品的復(fù)雜性，樣品中可能存在污染的滅活DNA，因此在LAMP檢測前，對(duì)樣品進(jìn)行選擇性預(yù)增菌培養(yǎng)，不僅可減少干擾，還可提高檢出率。在對(duì)200份進(jìn)境動(dòng)物檢疫樣品的檢測中，采取增菌培養(yǎng)后進(jìn)行檢測，檢出2份沙門氏菌陽性，與細(xì)菌分離鑒定檢測結(jié)果一致。證實(shí)了該方法的實(shí)用性。

4 結(jié)論

本研究采用基于HNB可視化顯色的方法，針對(duì)沙門氏菌侵襲因子A基因（invA）建立了LAMP檢測技術(shù)。該方法的最佳反應(yīng)溫度為61℃，檢測靈敏度為 3.6×101CFU/mL；特異性較好，與大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA、布魯氏菌試管凝集抗原DNA、炭疽沉淀抗原DNA以及豬鏈球菌2型DNA不發(fā)生交叉反應(yīng)；重復(fù)性可滿足實(shí)際要求，送檢樣品的檢測結(jié)果與細(xì)菌分離鑒定一致。試驗(yàn)表明，該方法適用于進(jìn)境動(dòng)物樣品的沙門氏菌快速檢測。