作物淀粉的三維熒光光譜指紋分析鑒定方法

張晉丹 吳明偉 馮曼

摘要：采用淀粉固體粉末進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，并對(duì)三維熒光光譜（EEMs）進(jìn)行平行因子分析（PARAFAC），研究了水稻、高梁、玉米等單子葉作物淀粉的熒光組分特征，探討了熒光組分特征與水稻品種的相關(guān)性。結(jié)果表明：不同來(lái)源的淀粉具有不同的熒光特性，可作為該物種淀粉的指紋圖譜;秈稻熒光組分的熒光強(qiáng)度明顯低于粳稻，經(jīng)過(guò)單因素方差分析，可確定秈稻和粳稻的淀粉熒光組分強(qiáng)度具有顯著差異，說(shuō)明該方法可用于秈粳稻淀粉的鑒別。

關(guān)鍵詞：淀粉;三維熒光光譜;平行因子分析;指紋圖譜

中圖分類號(hào)：0657.3;Q539+.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

引言

淀粉是植物的主要能量?jī)?chǔ)藏物質(zhì)，由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。直鏈淀粉是由葡萄糖殘基以a-1，4糖苷鍵連接而成，基本上呈線型。支鏈淀粉由許多小的直鏈分子組成，不同的小直鏈分子間以a-1，6糖苷鍵連接，形成分支。直鏈淀粉和支鏈淀粉所占比例以及支鏈淀粉的分支度決定淀粉的品質(zhì)和用途。研究表明，淀粉是一種熒光物質(zhì)，不同來(lái)源作物的淀粉結(jié)構(gòu)存在較大差異，構(gòu)成不同作物特征性淀粉熒光指紋圖譜。

三維熒光光譜（EEMs）技術(shù)作為一項(xiàng)有效的化學(xué)分析手段，具有速度快、取樣量少、信息量大、靈敏度高等特點(diǎn)，在水質(zhì)分析、綠茶成分鑒定、黃曲霉毒素等檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。平行因子分析（PARAFAC）方法是一種針對(duì)三維復(fù)雜數(shù)據(jù)的分析方法，能夠最大限度表征樣品中所有的熒光信息，將熒光信號(hào)分解成相對(duì)獨(dú)立的熒光矩陣，提高了分析的準(zhǔn)確性。目前三維熒光光譜技術(shù)結(jié)合平行因子分析方法已經(jīng)成為研究水環(huán)境中有機(jī)物溶解動(dòng)力學(xué)特征的重要工具。由于淀粉不溶于水和有機(jī)溶液，文獻(xiàn)【3】采用淀粉懸液進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，但光譜的均一性問(wèn)題限制了淀粉熒光分析方法的普遍應(yīng)用。

本文采用淀粉固體粉末進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，對(duì)三維熒光光譜進(jìn)行平行因子分析，研究水稻、高粱、玉米等單子葉作物淀粉的熒光組分特征，建立不同作物的熒光指紋圖譜，并初步探討了熒光組分特征、表觀直鏈淀粉含量（AAC）及水稻品種的相關(guān)性。

1測(cè)量方法

1.1三維熒光光譜測(cè)量

收集不同地區(qū)水稻品種53份、高粱品種14份、玉米品種18份。將成熟水稻種子加工成精米后粉碎，再經(jīng)37℃烘烤1周后過(guò)100目篩子，備用。將高粱和玉米直接粉碎，37℃烘烤一周后，過(guò)100目篩子，備用。

采用日立公司F-7000熒光光度計(jì)進(jìn)行三維熒光光譜測(cè)定，配以固體支架（零件號(hào)：650-0161），掃描速度為2400mm/min，激發(fā)和發(fā)射單色儀的狹縫設(shè)定為5mm，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的范圍為200～900mm，步長(zhǎng)為10mm。將采集到三種植物的三維熒光光譜數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在Excel表中，并存儲(chǔ)為f1.CSV形式。采用DOMFluor工具包在MATLAB 2007a軟件上對(duì)待測(cè)樣品三維熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平行因子分析，分析中設(shè)置非負(fù)性限制，去除瑞利和拉曼散射，并去除離群樣品，對(duì)剩余樣品的三維熒光光譜數(shù)據(jù)構(gòu)建成相應(yīng)作物的淀粉熒光組分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。熒光組分的數(shù)目由折半分析法確定（split-half analysis），每一熒光組分的特征由組分EEMs表示，每個(gè)熒光組分在每個(gè)樣品中的熒光強(qiáng)度以Fmax（RU）表示。

1.2水稻精米粉表觀直鏈淀粉含量測(cè)定及統(tǒng)計(jì)分析

準(zhǔn)確稱量10mg精米粉置于2mL離心管，加入100ul的無(wú)水乙醇，震蕩混勻，再加入900ul濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液，震蕩混勻后放入30℃培養(yǎng)箱靜置16 h使精米粉糊化。4份水稻不同表觀直鏈淀粉含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品（1.5%，10.2%，16.2%，26.4%）購(gòu)于中國(guó)農(nóng)科院水稻研究所（杭州），對(duì)這4份水稻按同樣的方法同時(shí)進(jìn)行糊化。

經(jīng)糊化后的樣品溶液與1 mL去離子水震蕩混勻，取10ul稀釋后的糊化溶液與990ul碘/碘化鉀溶液（20/0）混勻靜置20 min;然后吸取200ul反應(yīng)液加入96孔透明細(xì)胞培養(yǎng)皿中，利用酶標(biāo)儀（infinite M200 PRO）進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為680 nm。采用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，以及單因素方差分析。

2結(jié)果與討論

2.1水稻精米淀粉的熒光組分

根據(jù)PARAFAC模型，識(shí)別出水稻精米淀粉中有4個(gè)熒光組分（component，c），其中c1和c2為強(qiáng)熒光組分，如圖1所示，圖中Ex為激發(fā)光譜，Em為發(fā)射光譜。組分c1和c2包括單一發(fā)射峰和2個(gè)激發(fā)峰，組分c1（200，280/310 nm），組分C2（250，360/440nm）。組分c3和C4是弱熒光組分，含有2個(gè)激發(fā)峰和3個(gè)發(fā)射峰，組分C3（290，430/455，570，880nm），組分C4（270，410/480，550，820 nm）。

2.2高梁淀粉的熒光組分

根據(jù)PARAFAC模型，識(shí)別出高粱淀粉中有4個(gè)熒光組分，其中c1和c2為強(qiáng)熒光組分，如圖2所示。組分c1和c2包括單一發(fā)射峰和2個(gè)激發(fā)峰，組分C1（200，270/290 nm），組分C2（250，340/420 nm）。組分c3和C4是弱熒光組分，含有2個(gè)激發(fā)峰和3個(gè)發(fā)射峰。組分C3（270，400/430，520，800 nm），組分C4（290，430/430，560，860 nm）。

2.3玉米淀粉的熒光組分

根據(jù)PARAFAC模型，識(shí)別出玉米淀粉中有4個(gè)熒光組分，其中c1和c2為強(qiáng)熒光組分，如圖3所示。組分c1和c2包括單一發(fā)射峰和2個(gè)激發(fā)峰，組分C1（200，270/310 nm），組分C2（240，360/440nm）。組分c3和C4是弱熒光組分，含有2個(gè)激發(fā)峰和3個(gè)發(fā)射峰，組分C3（270，400/430，530，810nm），組分C4（290，430/450，570，880 nm）。

從3種作物的三維熒光光譜可以看出，不同來(lái)源淀粉的特征性熒光組分存在偏移和重疊現(xiàn)象。相對(duì)于高梁和玉米，水稻淀粉組分c2的熒光信號(hào)較弱。高粱淀粉組分c2的發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm，水稻和玉米淀粉組分c2的發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm。水稻組分c3的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移等。因此，通過(guò)比較這些特征性熒光組分的波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)弱可以區(qū)分不同來(lái)源的淀粉。

2.4水稻熒光組分強(qiáng)度分布與亞種的相關(guān)性

為了研究淀粉熒光組分與水稻亞種的相關(guān)性，我們分析了不同水稻品種的熒光組分強(qiáng)度和粳秈稻亞種的相關(guān)性，不同水稻的熒光強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果如表1所示。研究表明，秈稻熒光組分的熒光強(qiáng)度明顯低于粳稻的，經(jīng)過(guò)單因素方差分析，確定秈稻和粳稻的淀粉熒光組分強(qiáng)度具有顯著差異，其中熒光組分2顯著性p值小于0.01、熒光組分3顯著性p值小于0.01、熒光組分4顯著性p值小于0.05，如表2所示。

2.5水稻熒光組分強(qiáng)度分布與表觀直鏈淀粉含量的相關(guān)性

直鏈淀粉含量是水稻重要的品質(zhì)性狀之一，一般用表觀直鏈淀粉含量（AAC）來(lái)表征。為了確定熒光組分和直鏈淀粉的相關(guān)性，進(jìn)一步測(cè)定了這些品種的表觀直鏈淀粉含量（AAC）如表3所示，分析了水稻熒光組分強(qiáng)度與表觀直鏈淀粉含量（AAC）的關(guān)系。經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，Pearson相關(guān)系數(shù)低于0.2，顯著性p值雙側(cè)大于0.05，說(shuō)明兩者之間沒(méi)有相關(guān)性，如表4所示。

3結(jié)論

本文建立了固體樣品淀粉熒光光譜測(cè)定方法，并通過(guò)指紋圖譜區(qū)分不同來(lái)源的淀粉。這種測(cè)定方法不但可以避免淀粉熒光測(cè)量時(shí)面臨的溶質(zhì)不均性問(wèn)題，而且可以避免有機(jī)溶液產(chǎn)生的背景熒光，提升了測(cè)定方法的靈敏度和結(jié)果重現(xiàn)性。另外相對(duì)于主成分分析等二維數(shù)據(jù)分析方法，利用平行因子分析方法進(jìn)行三維數(shù)據(jù)分析，其解是唯一的，也可以避免主觀因素造成的分析結(jié)果差異。因此，作為一種新的淀粉測(cè)試分析方法，本研究能夠?yàn)椴煌瑏?lái)源的淀粉鑒定提供參考。