弱精子癥分子遺傳學(xué)的研究進(jìn)展

張國(guó)暉，梁高照綜述；汪 清審校

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 524000;2.廣東醫(yī)科大學(xué)深圳寶安臨床醫(yī)學(xué)院/深圳大學(xué)第二附屬醫(yī)院/深圳市第八人民醫(yī)院/深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518100)

弱精子癥(asthenozoospermia,AZS)是指精子活力PR級(jí)(a級(jí)+b級(jí))<32%的病癥，主要依靠常規(guī)精液分析進(jìn)行診斷，是男性不育最常見的類型。常規(guī)精液分析是判斷男性生育能力及診斷AZS的臨床指標(biāo)，但不能解釋精子運(yùn)動(dòng)缺陷的根本原因。AZS病因眾多，目前尚未闡明AZS形成的根本機(jī)制。精子的運(yùn)動(dòng)功能是由無數(shù)基因和各種信號(hào)通路共同協(xié)調(diào)的，目前普遍認(rèn)為，分子遺傳學(xué)改變是AZS發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。近年來，隨著高通量測(cè)序和基因芯片技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分基因改變及基因調(diào)控異常在AZS形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括精子鞭毛相關(guān)基因突變、線粒體DNA突變、miRNA調(diào)控異常及端粒長(zhǎng)度改變。本文重點(diǎn)討論國(guó)內(nèi)外關(guān)于AZS分子遺傳學(xué)改變的最新研究進(jìn)展。

1 基因突變

精子鞭毛多發(fā)性形態(tài)異常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)是一種嚴(yán)重的精子鞭毛畸形，包括缺失、盤繞、彎曲、有角度、不規(guī)則和短鞭毛[1]。精子運(yùn)動(dòng)主要依靠鞭毛擺動(dòng)提供前進(jìn)動(dòng)力。MMAF是降低精子運(yùn)動(dòng)力和活力的重要器質(zhì)性病變?；蛲蛔兪且餗MAF的主要原因，目前研究發(fā)現(xiàn)大范圍核苷酸缺失插入和單核苷酸突變均能導(dǎo)致鞭毛形態(tài)異常。

既往只有AKAP4、CCDC39和DNAH1三種基因被認(rèn)為是MMAF相關(guān)基因[2-4]，其中DNAH1突變是主要因素，約占MMAF的28%～44%[1-2]。早在2001年，NEESEN等[5]就報(bào)道DNAH1基因突變能引起纖毛擺動(dòng)頻率降低和AZS。近年來，越來越多文獻(xiàn)報(bào)道DNAH1基因突變引起MMAF及AZS[6]。DNAH1是一個(gè)含有78個(gè)外顯子的基因，編碼內(nèi)臂動(dòng)力蛋白重鏈，參與形成鞭毛中心結(jié)構(gòu)。DNAH1基因突變導(dǎo)致內(nèi)臂動(dòng)力蛋白形成及功能障礙，引起精子鞭毛多發(fā)性形態(tài)異常、精子纖維鞘發(fā)育不良(dysplasia of sperm fibrous sheath,DFS)、精子運(yùn)動(dòng)障礙及男性不育。DNAH1基因高度表達(dá)于睪丸，突變不引起體表纖毛功能改變[1]。據(jù)報(bào)道，鞭毛異常與非整倍體頻率升高和卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)療效差有關(guān)。然而，最近一項(xiàng)研究顯示，DNHA1突變的MMAF患者具有較低的非整倍體率和較高的DNA完整性，DNAH1突變MMAF患者與非MMAF患者相比，接受ICSI治療后的受精、妊娠和活產(chǎn)率并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[7]。這表明并非所有MMAF患者都存在染色體畸形，同時(shí)也為DNHA1突變患者的治療提供了新的見解。

近2年來，研究發(fā)現(xiàn)CFAP43、CFAP44、CFAP69及CFAP251也是引起MMAF的基因之一[8-11]。TANG等[12]首次表明CFAP43和CFAP44中的雙等位基因突變可導(dǎo)致MMAF并損害精子活力。CFAP43(也稱為WDR96)位于10號(hào)染色體上，含有38個(gè)外顯子，編碼含1 665個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。CFAP44(也稱為WDR52)位于3號(hào)染色體上，含有35個(gè)外顯子，編碼含1 854個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[11]。其編碼的蛋白質(zhì)TbCFAP43和TbCFAP44含有WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域(WDR)，比如N-末端區(qū)域共有β-鏈結(jié)構(gòu)域，C-末端區(qū)域共有α-螺旋結(jié)構(gòu)域，集中表達(dá)于鞭毛軸絲微管5、微管6和副鞭毛竿之間，精細(xì)調(diào)控該區(qū)域的蛋白質(zhì)復(fù)合物，在維持軸絲超微結(jié)構(gòu)中具有重要作用[11]。CFAP43和CFAP44基因突變誘導(dǎo)鞭毛軸絲解體，引起MMAF，表明CFAP43和CFAP44是精子鞭毛組裝和穩(wěn)定性所必需的基因，與精子鞭毛缺陷和AZS相關(guān)[11]。CFAP43和CFAP44不表達(dá)于體表細(xì)胞纖毛，突變不會(huì)引起原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙(primary ciliary dyskinesia,PCD)[12]。CFAP43和CFAP44突變的MMAF患者通過ICSI治療可獲得較為滿意的妊娠率[13]。CFAP69高度表達(dá)于睪丸，編碼位于鞭毛中段相對(duì)保守的蛋白質(zhì)，CFAP69的完整表達(dá)對(duì)于鞭毛組裝及穩(wěn)定結(jié)構(gòu)是不可或缺的，CFAP69雙等位基因突變不會(huì)影響精子發(fā)育過程，但能夠引起精子頭部嚴(yán)重畸形及鞭毛嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致常染色體隱性MMAF和原發(fā)性不育[8]。CFAP251編碼位于外周微管雙層內(nèi)表面蛋白質(zhì)，在穩(wěn)定RS3結(jié)構(gòu)和控制鞭毛運(yùn)動(dòng)中起重要作用，CFAP69突變影響精子線粒體鞘形成、鞭毛形態(tài)，導(dǎo)致男性不育[9-10,14]。此外，腺苷酸激酶7中的純合錯(cuò)義突變L673P也會(huì)引起MMAF和導(dǎo)致男性不育，并且不導(dǎo)致PCD[15]。

單核苷酸多態(tài)性主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，也是引起AZS的突變類型。白細(xì)胞介素(interleukin-1α，IL-1α)被認(rèn)為是精原細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，參與精子發(fā)生。一項(xiàng)關(guān)于伊朗男性IL-1ɑC376A單核苷酸突變的研究[16]發(fā)現(xiàn)，C等位基因突變與AZS相關(guān)；另一項(xiàng)對(duì)IL-1ɑ4845G> T的遺傳關(guān)聯(lián)研究[17]顯示，GT基因型、TT基因型、T等位基因與特發(fā)性男性不育之間存在相關(guān)性，4845TT基因型和4845T等位基因與少精子癥、AZS和非阻塞性無精子癥有關(guān)。然而這兩項(xiàng)研究?jī)H僅是初步研究，有待進(jìn)一步驗(yàn)證及闡明機(jī)制；同時(shí)鑒于不同地理區(qū)域的環(huán)境因素不同，因此在不同種族和人群中進(jìn)行更大樣本規(guī)模的研究是很必要的。此外近來發(fā)現(xiàn)GRP78啟動(dòng)子突變[18]、FSIP2突變[19]也是引起AZS的重要因素。

2 線粒體DNA突變

線粒體(mitochondrial)是精子能量的加工廠，通過有氧氧化為精子生長(zhǎng)發(fā)育、運(yùn)動(dòng)和受精等各個(gè)階段供應(yīng)能量，對(duì)精子活力和生育能力至關(guān)重要。線粒體DNA(mtDNA)缺失或突變通常導(dǎo)致精子活力下降，最后導(dǎo)致精子功能障礙和男性不育[20-22]。AMBULKAR等[23]發(fā)現(xiàn)AZS患者存在mtDNA7436-bp缺失，盡管mtDNA7436-bp缺失頻率較低，但對(duì)照組并沒有顯示mtDNA缺失。這表明mtDNA7436-bp缺失與精子活力低下相關(guān)，是精子功能障礙和無運(yùn)動(dòng)精子的重要原因之一。GHOLINEZHAD等[24]研究發(fā)現(xiàn)，AZS患者和正?？捎茉囌咧芯嬖趍tDNA4866-bp、mtDNA4977-bp和mtDNA7436-bp缺失，但AZS中多個(gè)mtDNA缺失的頻率顯著高于正常受試者。研究結(jié)果表明mtDNA的大規(guī)模缺失與精子活動(dòng)性降低和精子形態(tài)異常之間存在關(guān)聯(lián)，尤其是AZS患者。一項(xiàng)關(guān)于伊朗男性不育人群的mtDNA分析表明mtDNA7599 bp缺失與男性不育有關(guān)，然而這只是一項(xiàng)初步研究，有待進(jìn)一步驗(yàn)證[25]。綜合目前研究結(jié)果[26-27]，mtDNA缺失導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)性及活力下降的機(jī)制如下：第一，大規(guī)模mtDNA缺失致使其部分結(jié)構(gòu)基因和tRNA基因完全缺失或截?cái)啾磉_(dá)，從而導(dǎo)致功能障礙；第二，含有mtDNA缺陷的精子進(jìn)行氧化磷酸化活動(dòng)時(shí)，不僅不能有效地生成ATP，反而會(huì)產(chǎn)生更多活性氧和自由基，進(jìn)一步損害線粒體，同時(shí)促進(jìn)mtDNA突變或缺失，最終導(dǎo)致精子能量危機(jī)、精子活力和生育力下降；第三，大規(guī)模mtDNA缺失在精子發(fā)育過程中形成并不斷積累，最終損害呼吸功能并降低精子活力，這可能是男性生育能力下降甚至人體某些病理?xiàng)l件的重要因素之一。

除了mtDNA大范圍缺失突變外，mtDNA單核苷酸點(diǎn)突變也會(huì)對(duì)精子質(zhì)量產(chǎn)生影響。一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)男性線粒體DNA的新一代測(cè)序(next-generation sequencing,NGS)及單核苷酸分析研究[28]顯示，病例組C16179T基因突變發(fā)生率明顯高于對(duì)照組，并引起精子總數(shù)和運(yùn)動(dòng)性下降。但研究結(jié)果有待在更大群體的進(jìn)一步驗(yàn)證。另一項(xiàng)全基因組mtDNA單核苷酸多態(tài)性分析顯示，MT-ND4基因突變m.11696G>A與精子活力降低有關(guān)，證明m.11696G>A突變?cè)黾覣ZS的風(fēng)險(xiǎn)[29]。目前關(guān)于單核苷酸點(diǎn)突變影響精子發(fā)生和精子活力的機(jī)制尚未闡明，推測(cè)mtDNA點(diǎn)突變可能通過降低線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性而導(dǎo)致精子功能障礙[29]。

3 miRNA調(diào)控異常

MiRNA是一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸，可以調(diào)控大概60%蛋白質(zhì)編碼基因。MiRNA在多種生物過程中發(fā)揮重要作用，包括胚胎發(fā)生，細(xì)胞分化，器官發(fā)生，代謝和凋亡[30]。精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜、高度組織的過程，其中轉(zhuǎn)錄后miRNA調(diào)控是必不可少的過程[31]。然而目前僅有少許文獻(xiàn)報(bào)道了miRNA參與AZS調(diào)控。

精子miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)AZS精子microRNA表達(dá)失調(diào)。與正常精子對(duì)比，AZS患者有50種miRNA表達(dá)上調(diào)，27種miRNA表達(dá)下調(diào)，其中miR-34b、miR-122、and miR-1973表達(dá)差異最大[32]。既往的研究表明miR-122在圓形精子細(xì)胞中通過靶向特定mRNA參與轉(zhuǎn)錄蛋白2(transition protein 2，TNP2)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[33]，表明miR-122在睪丸發(fā)育或精子發(fā)生過程中起著重要的作用。miR-151a-5p是一種線粒體相關(guān)的miRNA[34]，既往多被認(rèn)為參與腫瘤形成、肝臟和心臟損失過程。ZHOU等[34]研究發(fā)現(xiàn)AZS患者miR-151a-5p顯著增加，并通過將miR-151a-5p轉(zhuǎn)染至GC-2細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)miR-151a-5p通過下調(diào)細(xì)胞色素B表達(dá)，抑制線粒體電子傳遞鏈活性，減少ATP生成，導(dǎo)致精子細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性減少。該研究首次系統(tǒng)性證明線粒體相關(guān)miRNA在AZS中的作用，揭示了miR-151a-5p通過調(diào)節(jié)CYTB水平導(dǎo)致AZS的分子機(jī)制，同時(shí)也為AZS治療提供潛在靶點(diǎn)。糖酵解已被證明是哺乳動(dòng)物精子鞭毛產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的重要途徑。let-7 miRNA家族參與了多種細(xì)胞過程和疾病發(fā)病機(jī)制的調(diào)節(jié)。let-7b-5p通過調(diào)節(jié)AURKB在細(xì)胞分裂過程中維持保真度。然而，關(guān)于let-7b-5p在生殖系統(tǒng)中的功能知之甚少。ZHOU等[35]分析糖酵解相關(guān)miRNA發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者相比，在重度AZS患者中僅發(fā)現(xiàn)1種精漿miRNA let-7b-5p顯著降低，并且通過敲掉miRNA let-7b-5p證實(shí)糖酵解活性降低。該研究表明miRNA let-7b-5p表達(dá)下調(diào)可以通過參與抑制糖酵解，減少鞭毛生成ATP，降低精子運(yùn)動(dòng)力。線粒體和糖酵解都是精子運(yùn)動(dòng)的能量來源，相關(guān)調(diào)控miRNA表達(dá)失調(diào)容易引起能量崩潰及精子運(yùn)動(dòng)下降。

正常情況下，精子活力是在附睪中獲得的，miRNA參與調(diào)節(jié)附睪微環(huán)境，為精子獲得活力提供基礎(chǔ)[36]。QING等[37]發(fā)現(xiàn)AZS患者中五種附睪miRNA(miR-891b，miR-892b，miR-892a，miR-888和miR-890)表達(dá)失調(diào)，表明miRNA群表達(dá)失調(diào)很可能是AZS的一種表觀遺傳基礎(chǔ)。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-34家族是精子發(fā)生所必需的[38]。LI等[39]研究發(fā)現(xiàn)miR-34c-3p和PLCXD3(phospholipase C X-domain containing 3)基因是一對(duì)miRNA-靶基因，PLCXD3位于睪丸生殖細(xì)胞內(nèi)，在少AZS患者中低表達(dá)，miR-34c-3p能夠降低PLCXD3表達(dá)，能夠作為特發(fā)性少精癥的標(biāo)志物；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)未曾報(bào)道的miR-411-5p，miR-375，miR-410和miR-758在精子生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但作用及機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。YANG等[40]發(fā)現(xiàn)隱睪患者睪丸組織中miR-34c明顯降低，Nanos2蛋白質(zhì)水平在小鼠模型中顯著上調(diào)，miR-34c/Nanos2的異常表達(dá)破壞了精原干細(xì)胞自我更新和分化之間的平衡，最終破壞了隱睪睪丸的精子發(fā)生，該項(xiàng)研究為隱睪癥引起的男性不育機(jī)制提供了新的見解。此外，據(jù)報(bào)道m(xù)iR-27a、miR-629-3p也是精子活力的調(diào)控因子，表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致嚴(yán)重AZS[41-42]。目前的研究已經(jīng)表明miRNA參與AZS的調(diào)控，但尚未發(fā)現(xiàn)AZS的特異性miRNA，有望進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AZS特異性miRNA，為AZS的診斷和治療提供新型生物標(biāo)記物。

4 精子端粒長(zhǎng)度改變

端粒包含非編碼串聯(lián)重復(fù)序列，可以保護(hù)染色體免受末端侵蝕，而不會(huì)導(dǎo)致遺傳信息丟失。在生殖細(xì)胞中，端粒長(zhǎng)度得以保留，表明端粒在維持人類配子發(fā)生和生育中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)精子端粒長(zhǎng)度(sperm telomere length，STL)與精子質(zhì)量顯著相關(guān)[43]。STL與精子運(yùn)動(dòng)力和精子活力呈正相關(guān)，與精子DNA片段化呈負(fù)相關(guān)，可以作為衡量精子質(zhì)量的標(biāo)記物[43]；還有研究報(bào)道STL與精子活性氧含量之間呈負(fù)相關(guān)，STL縮短會(huì)導(dǎo)致精子ROS增多，降低精子質(zhì)量；大量文獻(xiàn)報(bào)道STL與精子數(shù)量存在線性關(guān)系，少精子癥患者的STL比正常精子更短[43-45]。目前尚不清楚STL影響精子質(zhì)量的機(jī)制，部分學(xué)者認(rèn)為端?？赡馨l(fā)生分離錯(cuò)誤，功能失調(diào)的短端粒誘導(dǎo)精子DNA斷裂[46]，引起生殖細(xì)胞凋亡阻礙精子發(fā)生，生殖細(xì)胞中較短的端粒可能被認(rèn)為是生精障礙和男性不育的一個(gè)新的推定原因；另一方面，端粒長(zhǎng)度縮短可能是精子受損的標(biāo)志，即端粒長(zhǎng)度縮短可被視為后果，而不是精子發(fā)生改變的原因。然而，一些研究得出了截然不同的結(jié)論，認(rèn)為STL與精子質(zhì)量[47-48]、DNA片段化[47-49]、活性氧含量[48]無關(guān)，應(yīng)慎重考慮把CTL作為衡量精子質(zhì)量和男性不育的標(biāo)記物。最近一項(xiàng)研究[50]通過比較分析STL與精液質(zhì)量的關(guān)系及對(duì)預(yù)測(cè)輔助生殖的效果，認(rèn)為端粒在人類生殖中起關(guān)鍵重要作用，強(qiáng)烈建議把STL作為男性不育的生物標(biāo)志物。目前關(guān)于精子端粒長(zhǎng)度在精子質(zhì)量和男性不育方面的作用及機(jī)制尚無定論，有待進(jìn)一步研究闡明。

5 總結(jié)與展望

AZS是男性不育的主要原因之一。精子的發(fā)生和運(yùn)動(dòng)是由眾多基因共同協(xié)調(diào)的。近年來，關(guān)于精子發(fā)生和精子運(yùn)動(dòng)缺陷的基礎(chǔ)研究已經(jīng)取得了突破，目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些基因突變、miRNA表達(dá)失調(diào)、線粒體及鞭毛功能障礙參與AZS發(fā)生發(fā)展。然而，目前的研究多僅局限于單個(gè)基因改變引起的精子運(yùn)動(dòng)障礙，未來需要系統(tǒng)性的生物學(xué)研究，包括全方位考慮基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變，進(jìn)一步闡明AZS的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，為AZS診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。