生孢噬纖維菌研究進展

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(發(fā)酵工程教育部重點實驗室(湖北工業(yè)大學) 工業(yè)微生物湖北省重點實驗室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068)

目前，全球絕大部分的民用及工業(yè)能源消耗都是來自于石油、煤炭等化石燃料，隨著這些不可再生資源的日漸匱乏，發(fā)現新的替代能源成為時代的主題。天然纖維素是植物利用光能，通過光合作用生產的一類天然資源[1-2]。天然的纖維素分子化學性質穩(wěn)定，不溶于水，也不溶于有機溶劑。纖維素分子由許多β-G葡萄糖殘基組成，通過β-1,4糖苷鍵聯結起來[3]，由于連接在環(huán)上碳原子兩端的OH和H位置不相同，所以具有不同的性質。在天然纖維素中，聚合度可達10000左右；再生纖維素的聚合度通常為200～800。在一個樣品中，各個高分子的聚合度可以不同，具有多分散性。從上世紀40年代至今發(fā)現的能降解纖維素的微生物，既有好氧性微生物也有厭氧性微生物，既有細菌也有真菌。這些纖維素降解微生物中，霉菌具有較高的纖維素酶活而被廣泛研究利用，雖然細菌降解纖維素效率很高，但幾乎檢測不到相應的酶活力，這成為纖維素降解領域的一個未解問題。

生孢噬纖維菌是纖維素降解細菌中極具特色的一類生物群體，研究發(fā)現該類細菌能夠迅速降解濾紙纖維素、微晶纖維素粉等，并生產多糖等生物活性物質。生孢噬纖維菌區(qū)別于霉菌降解纖維素的方式引起了科學家的廣泛關注，闡明生孢噬纖維菌降解纖維素的分子機制對天然纖維素資源化利用具有重大的意義。生孢噬纖維菌對天然纖維素的生物降解不僅可以為生物質能源的利用提供一個途徑，且可以利用其生長代謝過程中生產多糖等物質為生產實踐應用奠定基礎。同時，生孢噬纖維菌的研究也為發(fā)展細菌降解纖維素領域的研究提供一個范例。

1 厭氧纖維素降解微生物

1.1 厭氧性纖維素降解真菌

在反芻動物中的瘤胃中存在一定數量的厭氧真菌，厭氧真菌生產大量的高活性纖維素酶降解植物的木質化組織。瘤胃中的主要優(yōu)勢菌屬于真菌界Neocallimastigales目的真菌[14]，該類菌群在木質纖維素的降解中起著重要作用。與其他瘤胃微生物相比，瘤胃厭氧真菌不僅能分泌比較全的降解天然木質纖維素酶系，而且能降解晶體狀的、結構復雜的纖維素[4]。除了瘤胃細菌外，厭氧的真菌也可以參與纖維素的降解。1977年，Orpin首次證明厭氧真菌具有降解植物細胞壁的能力[5-6]，之后大量實驗證明：厭氧真菌是食草動物消化道內降解木質纖維素最有效的微生物類群[7]。

1.2 厭氧性纖維素降解細菌

天然存在的能降解纖維素的厭氧細菌以高溫菌最為典型，它們在高溫厭氧的條件下具有很強的纖維素降解能力，其產生纖維素酶具有極強的熱穩(wěn)定性。上世紀50年代，G. Halliwell等采用滾瓶法獲得了厭氧菌的純培養(yǎng)[8]，基于此方法熱纖梭菌等多株厭氧細菌被分離純化出來[9-13]，針對這些厭氧細菌的生理學和生物化學特性進行了大量的研究。降解纖維素的厭氧細菌包括一些革蘭陰性細菌和全部革蘭陽性細菌。革蘭陽性細菌包括梭狀芽孢桿菌屬、厭氧纖維菌屬(Anaerocellum)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、真桿菌屬(Eubacterium)，還有部分的螺旋體(Spirochaeta)也有降解纖維素的能力，例如嗜熱螺旋體(S.thermophila)。革蘭陰性細菌包括熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)、醋弧菌屬(Anaerocellum)、絲狀桿菌屬(Fibrobacter)、閃爍桿菌屬(Feridobacterium)、嗜鹽菌屬(Halocella)和棲熱袍菌屬(Thermotoga)[14]。

2 好氧性纖維素降解微生物

2.1 好氧性纖維素分解真菌

真菌被認為是自然界中有機物質的降解生物，它對纖維素的降解能力尤為突出。許多真菌都具有很強的纖維素分解能力。在潮濕土壤中，真菌是纖維素分解的優(yōu)勢菌群。真菌類有黑曲霉、臥孔屬、血紅栓菌、繩狀青霉、疣孢漆斑菌 QM460、變幻青霉、乳齒耙菌、變色多空霉、腐皮鐮孢、康氏木霉、綠色木霉、里氏木霉、嗜熱毛殼菌 QM9381 和嗜熱子囊菌 QM9383等[15]。其中研究較多的是木霉屬，因其高產量的纖維素酶而被廣泛應用。

2.2 好氧性纖維素分解放線菌

放線菌分解纖維素的能力較弱，但在不利條件下放線菌比其他微生物更能耐受高溫和各種酸堿環(huán)境。高溫放線菌可以從自然界中許多地方分離出來,如沙子、成熟堆肥、馬糞和果園土中。主要包括諾卡氏菌屬(Nocardia)、節(jié)桿菌(Arthrobucter)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、小單孢菌屬(Micromonspora)和鏈霉菌屬(Streptomyces)等。從堆肥中分離出來的多種嗜熱單孢菌，具有分解木質素材料中纖維素的能力[16-22]。吳翔[23]等人從高溫稻草堆肥中分離到1株能降解纖維素的放線菌CN 9,研究發(fā)現菌株CN 9在培養(yǎng)第3天就產生豐富的基內菌絲,并且不斷裂,隨后在基內菌絲上逐漸形成大量的長直孢子鏈。且該菌株生長溫度和生長所需pH均較廣。劉東波、高培基、王祖農教授等于 1990 年通過吉林長白山黑土地中分離到一株同時具有降解纖維素和固氮能力的諾卡氏放線菌[24]。

2.3 好氧性纖維素分解細菌

在自然界中分布的纖維素降解細菌主要包括纖維弧菌屬(Cellvibrio)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)和噬纖維菌屬(Cytophaga)等[9]。這些細菌大多數是能夠進行活潑運動的中溫好氧菌，其對天然的纖維素的分解能力一般較弱。20 世紀 50～60 年代，山東大學王祖農教授對好氧性纖維素細菌的分離純化方法作了改進，并且得到了嗜鹽性菌株[25]。

纖維素降解細菌中很有特色的生孢噬纖維菌因為在纖維素底物上可以很快滑動，因此，為分離純化帶來了極大困難，國內山東大學的法明、高培基等人通過改進實驗方法，采用雙層平板法提高了培養(yǎng)基的選擇性，并且從土壤中分離篩選到了一株好氧性降解纖維素的生孢噬纖維菌[2]，由于生孢噬纖維菌分離純化非常困難，到目前為止，國內外也只有很少幾個實驗室擁有生孢噬纖維菌菌種。

3 生孢噬纖維菌

3.1 生孢噬纖維菌降解特點

生孢噬纖維菌是土壤中常見的好氧性纖維素分解細菌，其對纖維素的分解能力極其強大，且對纖維素有不同程度的專一性。它在濾紙上生長時，濾紙表面會出現肉眼可見的淡黃色的菌落，并有黏液，并且在長有菌落處的濾紙已經溶解變薄，最重要的是其分解所需要的時間極短。生孢噬纖維細菌是非常有特色的好氧性降解纖維素細菌，它屬于能夠降解纖維素的滑動細菌，能夠在固體纖維素表面快速滑動，電子顯微鏡研究表明，滑動和產生粘液的細菌與纖維素原纖維緊密接觸，其主軸平行于微纖維[26]。生孢噬纖維菌依靠滑動，能夠吸附到賴以生長的不溶性固體介質表面獲取營養(yǎng)，同時產生大量胞外多糖，這種特性對于降解不溶性纖維素有著非常重要的作用[1]。

3.2 生孢噬纖維菌生產多糖

微生物多糖主要是由細菌、真菌和藍藻類產生，由于各種菌生長的環(huán)境不同，其遺傳及生理特性與其他生物相比也大不相同，因此也產生了具有獨特功能的活性多糖，通過對各種細菌的大量研究，人們發(fā)現了多種具有不同特性的細菌多糖，分別具有抗腫瘤、增強免疫作用、抗病毒、抗細菌、抗輻射等生物學活性。生孢噬纖維菌作為一類具有較強纖維素降解能力的好氧性滑動細菌，同時產生大量的胞外多糖。Coughln[27]等人在進行Sporocytophaga的生理生態(tài),分離鑒定等工作時,同時指出該菌株產生的多糖具有免疫增強活性等多種生物學功能，可用于開發(fā)免疫增強劑和其他多糖類藥物。

3.3 生孢噬纖維菌生產纖維素酶

纖維素酶是廣泛存在于自然界生物體中一類纖維素降解酶。細菌、真菌、動物體內等都能產生纖維素酶，而在工業(yè)生產上應用廣泛的是來自子囊菌的絲狀真菌類群[28]。劉金勝[29]等人曾經用幾種農藥對厭氧纖維分解菌降解纖維素的活性進行測定，結果發(fā)現除草劑卞嘧磺隆和丁草胺對纖維分解菌的活性影響均不大,甚至對纖維素降解菌的分解活力具有少量的促進作用。而殺蟲劑三唑磷在濃度為0.8 mg/L以上時,對纖維分解菌具有明顯的抑制作用。王秀然等于2012年使用葡聚糖凝膠過濾、DEAE離子交換技術，通過生孢噬纖維菌Sporocytophagasp. JL-01純化了纖維素酶組分FPase1，該FPase1纖維素組分具有55 kDa分子量，50℃時表現出最佳濾紙酶活[30]。1975年，Kristian[31]等從生孢噬纖維菌Sporocytophagamyxococcoides的培養(yǎng)上清液中分離出兩種具有低含量碳水化合物、氨基酸組成非常相似，且表現出羧甲基纖維素酶活的細胞外纖維素酶。Kristian等通過研究鑒定了這兩種纖維素酶成分 ,獲知兩種纖維素酶都是作為內切葡聚糖酶而發(fā)揮活性。

3.4 生孢噬纖維菌分子水平研究

國內外專家普遍認為，基因組序列圖在分子層面上取得的突破，推動了生命與醫(yī)學科學的革命性進展。Sporocytophagamyxococcoides是一種從土壤中分離出的有效的降解纖維素的生孢噬纖維菌。2014年，Liu L 等測定了其基因組序列草圖，并得出有助于該細菌的纖維素降解能力的纖維素分解酶以及半纖維素分解酶的重要遺傳信息[32]。劉建[33]等人通過在SDS加熱裂解法的基礎上，再進行了30s的沸水浴處理從而獲得了純度高、完整性好的基因組DNA，并利用其進行了纖維素酶表達的初步試驗，在研究中發(fā)現纖維素酶能夠被分泌到胞外，并且具有一定的活力，這為生孢噬纖維菌纖維素酶的進一步研究奠定了基礎。

4 結論與展望

纖維素的生物降解現象早在 1886 年就被發(fā)現，但直到 1950 年之后才有纖維素酶相關的比較系統(tǒng)性文章報道。這些天然纖維素降解的報道多集中于真菌纖維素降解的報道。目前，國內外對生孢噬纖維菌的報道甚少，通過研究發(fā)現，生孢噬纖維菌具有極強的纖維素降解能力，但對其纖維素降解機制卻知之甚少，特別是幾乎檢測不到纖維素酶活[1]。關于其對纖維素的降解機制及纖維素酶的特性研究還需要進一步完善

關于生孢噬纖維菌胞外多糖的研究還有很大的提升空間，迄今為止，國外僅有Coughln[27]等人在對有關 Sporocytophaga 的生理生態(tài),分離鑒定等做闡述的同時，指出該菌株產生的多糖具有免疫增強活性等多種生物學功能，可用于開發(fā)免疫增強劑和其他多糖類藥物。國內有王浩[34]等人于1996年對生孢噬纖維菌胞外多糖的研究，發(fā)現其產生的胞外多糖有一定的抗鹽性，適應酸堿的能力，以及耐受高溫。但其發(fā)酵周期太長，且產率太低。

目前，生孢噬纖維菌的研究進展極其緩慢，存在著很大不足，如需要發(fā)現新的篩選菌種的手段，發(fā)現其獨具特色的纖維素酶，進行比較基因組學、比較轉錄組學領域的研究。在未來科技手段進步的條件下，相信這些研究瓶頸都會得到解決。利用生孢噬纖維菌降解纖維素不僅可以減少資源的浪費，且在食品、環(huán)保、保健品等行業(yè)利用具有一定促進作用。生孢噬纖維菌纖維素降解機制的闡明及其代謝產物的生產定會為天然纖維素的利用提供新的思路。